以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5760.3 —2024 进出口化妆品中病原菌检测方法 微滴式数字 PCR 法 第 3 部分：铜绿假单胞菌 Droplet digital PCR method for detection of pathogens in cosmetics for import and export — Part 3: Pseudomonas aeruginosaICS 71.100.70 CCS Y 42 中华人民共和国海关总署 发 布2024 -12-16发布 2025 -06-01 实施以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5760.3—2024I前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020《标准化工作导则 第 1 部分 : 标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件为 SN/T 5760— 2024《进出口化妆品中病原菌检测方法 微滴式数字 PCR 法》的第 3 部分。 SN/T 5760— 2024 已经发布了以下部分： ——第 1 部分：大肠埃希氏菌； ——第 2 部分：金黄色葡萄球菌； ——第 3 部分：铜绿假单胞菌； ——第 4 部分：肺炎克雷伯氏菌； ——第 5 部分：洋葱伯克霍尔德菌； ——第 6 部分：沙门氏菌； ——第 7 部分：白色念珠菌； ——第 8 部分：破伤风梭菌； ——第 9 部分：柠檬酸杆菌； ——第 10 部分：嗜麦芽窄食单胞菌。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中国海关科学技术研究中心、深圳海关食品检验检疫技术中心、北京林电伟 业电子技术有限公司、北京市农林科学院、北京电子科技职业学院、北京市医疗器械检验研究院（北 京市医用生物防护装备检验研究中心） 、中国食品药品检定研究院、北京新羿生物科技有限公司。 本文件主要起草人：王艺凯、赵芳、邱烨、祝天宇、贾文珅、王红、李达、邹迎曙、黄杰、刘 东来、芮孝、王胜利。以正式出版文本为准以正式出版文本为准III SN/T 5760.3—2024引 言 化妆品中病原菌可通过不同途径进入机体，对消费者的健康带来风险。SN/T 5760—2024《进出 口化妆品中病原菌检测方法 微滴式数字 PCR 法》采用微滴式数字 PCR 法，对化妆品中 10 种代表性 病原菌进行检测，旨在建立灵敏度高、抗干扰能力强的检测方法，以保护消费者健康，促进化妆品进 出口贸易。SN/T 5760— 2024 由 10 个部分组成： ——第 1 部分：大肠埃希氏菌； ——第 2 部分：金黄色葡萄球菌； ——第 3 部分：铜绿假单胞菌； ——第 4 部分：肺炎克雷伯氏菌； ——第 5 部分：洋葱伯克霍尔德菌； ——第 6 部分：沙门氏菌； ——第 7 部分：白色念珠菌； ——第 8 部分：破伤风梭菌； ——第 9 部分：柠檬酸杆菌； ——第 10 部分：嗜麦芽窄食单胞菌。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5760.3—2024进出口化妆品中病原菌检测方法 微滴式数字 PCR 法 第 3 部分：铜绿假单胞菌 1 范围 本文件描述了进出口化妆品中铜绿假单胞菌的微滴式数字 PCR 检测方法。 本文件适用于进出口化妆品中铜绿假单胞菌的快速检测。 本文件所能达到的检出限（LOD50）为 0.50 CFU/g（mL）~1.37 CFU/g（mL） 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单 ) 适 用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 SN/T 5075 化妆品微生物检验制样规范 化妆品安全技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA ：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid） ddPCR ：微滴式数字 PCR（droplet digital Polymerase Chain Reaction） PCR ：聚合酶链式反应 （Polymerase Chain Reaction） 16S rRNA ：16S 核糖体 RNA（16S ribosomal RNA） 5 方法原理 针对铜绿假单胞菌 16S rRNA 编码基因的保守序列设计引物、探针，将一定浓度的引物、探针与 模板 DNA 及数字 PCR 反应预混液混合，配成 PCR 反应体系。将该数字 PCR 体系分布到 12 000 个 ~20 000 个微滴中，使大部分微滴中模板 DNA 分子的数量为 1 或 0，然后进行 PCR 扩增。16S rRNA 探针 5’端标记 VIC 荧光基团，3’端标记 BHQ1。利用数字 PCR 系统的检测通道，可对每个微滴的 荧光信号进行采集分析。含有模板 DNA 的微滴出现荧光信号的增强，形成阳性微滴簇。最终根据阳以正式出版文本为准2 SN/T 5760.3—2024性微滴的有无判定样品中是否含有铜绿假单胞菌。 6 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 6.1 恒温培养箱：36 ℃ ± 1 ℃。 6.2 冰箱：2 ℃ ~8 ℃、-20 ℃。 6.3 均质器或乳液分散机（转速 1 000 r/min 以上） 。 6.4 电子天平：感量 0.1 g。 6.5 高速微量离心机（最大离心力不小于 10 000 g） 。 6.6 涡旋振荡仪。 6.7 加热装置：95 ℃ ~100 ℃。 6.8 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.9 无菌均质袋或均质杯。 6.10 生物安全柜。 6.11 ddPCR 扩增仪及相关配套设备。 6.12 移液器及配套吸头：100 µL~1 000 µL、20 µL ~200 µL、10 µL ~100 µL、0.5 µL ~10 µL。 6.13 离心管：2 mL、1.5 mL 和 0.2 mL。 6.14 阳性对照：铜绿假单胞菌 ATCC 27853 或等效菌株或含目的片段的 DNA。 7 材料与试剂 7.1 仅使用分析纯试剂和符合 GB/T 6682 规定的一级水。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。 7.2 DNA 提取液：见附录 A 中 A.1。 7.3 大豆酪蛋白卵磷脂吐温 80（SCDLP）液体培养基：见附录 A 中 A.2。 7.4 细菌基因组提取试剂盒。 7.5 生理盐水：见附录 A 中 A.3。 7.6 ddPCR 反应配套试剂。 7.7 铜绿假单胞菌 16S rRNA 编码基因特异性序列片段参见附录 B，引物探针序列如下： Primer-F ：5’-CGAGCGCAACCCTTGTCCTTA-3’ Primer-R ：5’-CGTCATCCCCACCTTCCTCCG-3’ Probe-P ：5’-VIC-TTACCAGCACCTCGGGTGGGC-BHQ1-3’ 8 检验程序 进出口化妆品中铜绿假单胞菌 ddPCR 检验程序见图 1。