以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5758 —2024 埃博拉出血热检疫技术规范 Quarantine protocol for Ebola haemorrhagic fever 2024 -12-16发布 2025 -06-01 实施ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5758—2024I前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国南京海关、中国海关科学技术研究中心、中华人民共和国上 海海关、中华人民共和国昆明海关、中华人民共和国南宁海关、中华人民共和国深圳海关、江西省科 学院生物资源研究所。 本文件主要起草人：龙云凤、祝贺、汪琳、李健、姜焱、杨春华、王群、贾赟、陆冠亚、赵晓 燕、陈晓芳、姜珊、胡珀、艾军、左天荣、秦智锋。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5758—2024埃博拉出血热检疫技术规范 1 范围 本文件描述了埃博拉病毒的 RT-PCR 和实时荧光 RT-PCR 检测方法。 本文件适用于出入境动物埃博拉出血热的检疫。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 SN/T 2984 检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct 值：阈值循环数（cycle-threshold value） dNTPs ：脱氧核糖核苷酸（deoxynucleotide triphosphates） DEPC ：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate） PCR ：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） RNA ：核糖核酸（ribonucleic acid） RT-PCR ：逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction） Taq：水生栖热菌（ Thermus aquaticus ） 实时荧光 RT-PCR ： （real-time RT-PCR） 5 生物安全 埃博拉出血热是一种人兽共患病（见附录 A） ，实验室生物安全应符合 GB 19489 的规定。按照 SN/T 2984 的规定操作相应的试验材料，未经培养的感染材料的操作在 BSL-3 生物安全实验室内进行， 灭活的材料和进出境检测样品可在 BSL-2 生物安全实验室内操作。以正式出版文本为准2 SN/T 5758—20246 仪器和设备 6.1 PCR 扩增仪。 6.2 荧光定量 PCR 仪。 6.3 水平电泳仪。 6.4 凝胶成像仪。 6.5 普通冰箱和 -80 ℃冰箱。 6.6 低温冷冻离心机（可控温至 4 ℃，离心速度可达 12 000 g以上） 。 6.7 二级生物安全柜。 6.8 高压灭菌锅。 6.9 微量可调移液器（ 2 μL ，10 μL ，100 μL ，1 000 μL ）及配套带滤芯吸头。 7 试剂和材料 在检测中使用的试剂均为分析纯，试验用水应符合 GB/T 6682 的一级水的要求。 7.1 Trizol。 7.2 DEPC 处理水（见 B.1） 。 7.3 PBS ：0.1 mol/L （见 B.2） 。 7.4 三氯甲烷。 7.5 异丙醇：使用前 -20 ℃预冷。 7.6 75% 乙醇：用 DEPC 水和无水乙醇配制，使用前 -20 ℃预冷。 7.7 溴化乙锭（EB） ：10 mg/mL，使用浓度为 0.5 μg/mL 。 7.8 Taq DNA 酶：-20 ℃保存。 7.9 dNTPs ：含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmol/L 的混合物，-20 ℃保存。 7.10 AMV 逆转录酶：-20 ℃保存。 7.11 琼脂糖。 7.12 DNA Marker（100 bp~2 000 bp） 。 7.13 TBE 电泳缓冲液（见 B.3） 。 7.14 上样缓冲液。 7.15 2× 荧光 PCR 预混液。 8 检验程序 8.1 样品采集、保存及运输 样品的采集按照 GB/T 18088 执行。样品温度应保持在 0 ℃ 以下。样品的保存和运输的生物安全 要求参照《病原微生物实验室生物安全管理条例》的有关要求执行。 8.2 实验室检测 8.2.1　样品处理 组织样品先去除包膜和其他结缔组织，选取内部实质部分，置研钵中，加入石英砂充分研磨， 然后按照 1∶5 比例加入 0.1 mol/L PBS（pH 7.6~pH 7.8） ，4 ℃浸泡过夜或者 -20 ℃ 反复冻融 2 次，每 次 30 min，4 ℃ 条件下以 8 000 g离心 5 min，取上清进行后续操作。 液体样品如血液、尿液、唾液不必经过研磨或冻融处理，直接进行后续操作。不能立即进行检测以正式出版文本为准3 SN/T 5758—2024时，样本冻存于 -70 ℃左右超低温冰箱备用。 8.2.2　病毒核酸提取 8.2.2.1　Trizol 法 取灭菌的 1.5 mL 离心管，做好标识。 每管加入 600 μL裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、 阳性对照各 200 μL，再加入 200 μL三氯甲烷，紧盖离心管，混匀器上振荡混匀 15 s 后室温静置 5 min，于 4 ℃ 12 000 g离心 15 min。取新的灭菌的 1.5 mL 离心管，加入 -20 ℃预冷 400 μL异丙 醇，吸取离心后将各管中的上清液转移至预冷的异丙醇中，避免吸出中间层，颠倒混匀。于 4 ℃ 12 000 g离心 15 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沥干液体，加入 600 μL 75% 预冷乙醇，颠倒洗 涤。于 4 ℃ 12 000 g离心 10 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沥干液体，室温干燥 5 min ~10 min。 加入 15 μL~20 μL DEPC 水，溶解管底的 RNA，5 000 g离心 5 s，冰上保存备用，若长期保存应放 置在 -70 ℃冰箱。 8.2.2.2　核酸提取等效方法 埃博拉病毒核酸提取也可以采用等效 RNA 提取试剂及方法，如采用商品化试剂盒或自动化核酸 抽提仪和配套核酸抽提试剂进行核酸抽提。 8.2.3　阳性对照、阴性对照和空白对照 检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为根据埃博拉病毒核苷酸序列通 过基因合成、载体构建和体外转录合成的 RNA，以及包含埃博拉病毒 NP 或 GP 基因的假病毒，阴性 对照可选择其他类病毒的核酸样本，空白对照为无菌水作为扩增模板。 8.2.4　RT-PCR 检测方法 8.2.4.1　检测引物 NP 基因扩增引物： 上游引物 NP F ：5’ -GAGTATGCTCCTTTCGC-3’ 下游引物 NP R ：5’ -TTTGGTATTCGCCGTAG-3’ GP 基因扩增引物： 上游引物 GP F ：5’ -GCAAGTGGGAAGAGGAG-3’ 下游引物 GP R ：5’ -CACGGGTGTATTATGGGT-3’ 引物工作浓度均为 10 μmol/L ，配制后于 -20 ℃左右保存。扩增目的基因片段长度分别为 NP 基 因 538 bp、GP 基因 396 bp。 RT-PCR 扩增产物参考序列见附录 C。 8.2.4.2　RNA 逆转录 在冰盒上配制 20 µL 逆转录反应体系。在 0.2 mL 离心管中依次加入：DEPC 处理水 6.5 µL，随机 引物（25 µmol/L）2 µL，dNTPs（各 10 mmol/L）1 µL，模板 RNA（10 ng/ µL~1 000 ng/ µL）或空白对 照 5 µL。混匀，短暂离心，65 ℃ 保温 5 min 后，冰上迅速冷却。然后在上述反应管中加入：5× 逆 转录酶缓冲液 4 µL，RNA 酶抑制剂（40 U/ µL）0.5 µL，AMV 逆转录酶（200 U/ µL）1 µL。缓慢混匀。 按以下程序进行 cDNA 合成：30 ℃ 10 min，42 ℃ 45 min ；95 ℃ 5 min 灭活逆转录酶，冰上冷却。合 成的 cDNA 可立即用于 PCR 扩增，或保存于 -20 ℃备用。 可采用同等逆转录效率的商品化逆转录试剂盒。以正式出版文本为准4 SN/T 5758—2024可采用同等逆转录效率的商品化一步法 RT-PCR 试剂盒。 8.2.4.3　PCR 反应 在 PCR 反应管中依次加入：去离子水 33 μL，10×Taq DNA 聚合酶缓冲液（不含 Mg2+）5 μL， MgCl2（25 mmol/L）3 μL，dNTPs（各 10 mmol/L）1 μL，引物 NP F 和 NP R 或（GP F/GP R）各 1 μL， Taq DNA 聚合酶 （5 U/μL ）1 μL，合成的 cDNA 5 μL。 混匀，置于 PCR 仪中。 按以下程序进行 PC