以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 鱼类及其制品中金枪鱼、鳕鱼和虹鳟鱼成分   快速检测方法    PCR—试纸条法 Rapid detection of Thunnus, Gadus and Oncorhynchus mykiss ingredient in fish and fish products — PCR —Lateral flow dipstick method 2023 -12-29发布 2024 -07-01 实施ICS 687.050 CCS X 04 中华人民共和国海关总署 发 布SN/T 5742 —2023以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5742—2023I前  言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国天津海关、天津师范大学、韶关学院（广东省粤北食药资源利 用与保护重点实验室） 、青海大学。 本文件主要起草人：赵良娟、王飞、杨爽、郑文杰、张霞、李长忠、季超、金文杰、刘金玉。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5742—2023鱼类及其制品中金枪鱼、鳕鱼和虹鳟鱼成分快速检测方法    PCR—试纸条法 1 范围 本文件描述了鱼类及其制品中金枪鱼成分、鳕鱼成分、虹鳟鱼成分检测的 PCR—试纸条方法。 本文件适用于蓝鳍金枪鱼、长鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼、大眼金枪鱼、太平洋鳕鱼、大西洋鳕 鱼、黑线鳕鱼、狭鳕、虹鳟及其制品中金枪鱼成分、鳕鱼成分、虹鳟鱼成分的 PCR—试纸条定性检测。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引 用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修 改单）适用于本文件 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403— 2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 GB/T 35918 动物制品中动物源性检测基因条码技术 Sanger 测序法 3　术语和定义 下列术语和定义适应于本文件。 3.1　 金枪鱼 Thunnus 属于鲈形目（ Perciformes ） ，鲭科（ Scombridae ）大型远洋性重要商品食用鱼的统称。 注1： 见于世界暖水海域，与鲭、鲐、马鲛等近缘，通常同隶鲭科。常见被称为金枪鱼的商品鱼类有蓝鳍金枪 鱼（ Thunnus thynnus ） 、长鳍金枪鱼（ Thunnus alalunga ） 、黄鳍金枪鱼（ Thunnus albacares ） 、大眼金枪鱼（ Thunnus obesus ）。 注2： 本文件中金枪鱼成分即指金枪鱼特异性 DNA 片段。 3.2 鳕鱼 Gadus 鳕形目（Gadiformes）鱼类，主要指鳕科（Gadidae）和无须鳕科（Merlucclidae）的鱼类。 注：本文件中鳕鱼成分即指鳕鱼特异性 DNA 片段。 3.3　 虹鳟 Oncorhynchus mykiss 鲑形目鱼类，鲑科、太平洋鲑属的一种鲑鱼。 注：本文件中虹鳟鱼成分即指虹鳟鱼特异性 DNA 片段。以正式出版文本为准2 SN/T 5742—20234　缩略语 下列缩略语适应于本文件。 CTAB ：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium bromide） 。 DNA ：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid） 。dNTP ：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleoside triphosphate） 。 EDTA ：乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetraacetic acid） 。 FITC ：异硫氰酸盐（Fluorescein 5-isothiocyanate） 。Tris ：三羟甲基氨基甲烷［Tris（Hydroxymethyl）aminomethane］ 。 5　方法原理 利用裂解液破碎样本细胞，苯酚 - 氯仿法抽提基因组 DNA，以提取的 DNA 为模板，采用上 游和下游引物分别经异硫氰酸盐和生物素标记进行 PCR 扩增，获得两端分别带有异硫氰酸盐和生物素分子的 PCR 产物。用含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条对 PCR 产物进行筛选检测，并对 PCR 阳性产物进行测序确证。 6　试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合 GB/T 6682 的要求。 6.1   检测用引物（对）序列及标记物 检测用引物（对）序列及标记物详见表 1。 表 1   引物（对）序列及标记物 物种名称 引物序列（5 ’→3 ’） 5’端标记物 靶基因 金枪鱼F ：5 ’— TGGTATCAGGCACACCCAA-3 ’ 异硫氰酸盐 12srRNA R ：5 ’— CGCCGGTGTCTGTCAACTT-3 ’ 生物素 鳕鱼F ：5 ’— TCTAGGCCTTTGCTTAATTACT-3 ’ 异硫氰酸盐 CYTB R ：5 ’— CCTACGAAAGAGGTTATTATTACT-3 ’ 生物素 虹鳟F ：5 ’— GTCCCACTGTGGCTTGCT-3 ’ 异硫氰酸盐 ATP6 R ：5 ’— GGGTTCCTTCAGGCAATAA-3 ’ 生物素 6.2 试剂 6.2.1 Ex Taq Hot Start DNA 聚合酶。 6.2.2 dNTPs ：dATP（脱氧腺苷三磷酸） 、dTTP（脱氧胸苷三磷酸） 、dCTP（脱氧胞苷三磷酸） 、 dGTP（脱氧鸟苷三磷酸） 。 6.2.3 三氯甲烷（氯仿） 。 6.2.4 异丙醇。以正式出版文本为准3 SN/T 5742—20236.2.5 CTAB 提取液：称取 4.0 g CTAB，16.364 g NaCl，加入 20mL 1 mol/LTris-HCl 溶液，8 mL 500 mmol/L Na2-EDTA 溶液，先用 70mL 双蒸水溶解，再定容至 200mL，在 103.4kPa（121 ℃） 条件下灭菌 20min。 6.2.6 CTAB 沉淀液：称取 1.0 g CTAB，0.467g NaCl，先用 70mL 双蒸水溶解，再定容至 200 mL， 在 103.4kPa（121 ℃）条件下灭菌 20min。 6.2.7 25 ： 24 ： 1 酚 / 三氯甲烷 / 异戊醇溶液。 6.2.8 24 ： 1 三氯甲烷 / 异戊醇溶液。 6.2.9 氯化钠溶液（1.2 mol/L） ：在 200 mL 双蒸水中加入 35.05 g 氯化钠（NaCl） ，溶解后再加 双蒸水定容至 500 mL。 6.2.10 氢氧化钠溶液（1 mol/L） ：在 160 mL 双蒸水中加入 8 g 氯化钠（NaOH） ，溶解后再加双 蒸水定容至 200 mL。6.2.11 Tris-HCl 溶液 （1 mol/L） ：称取 121.1 g Tris 溶解于 800 mL 双蒸水中，用 HCL 调 pH 至 8.0， 加双蒸水定容至 1000 mL。在 103.4kPa（121 ℃）条件下灭菌 20 min。 6.2.12 蛋白酶 K （670U/mL） ：称取 0.10 g 酶活为 33.5 U/mg （Unit，酶学单位） 的蛋白酶 K 干粉， 加入 5 mL 双蒸水，轻轻摇动，直至蛋白酶 K 完全溶解，分装成小份贮存于 -20 ℃。 6.2.13 试纸条：含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测 试纸条，可通过采购的原料试剂自行组装（见附录 A）或采用等效的商品化试纸条。6.2.14 展开液：取 2 µL1mol/L Tris-HCl 溶液，200 µL10mg/mLBSA，2 mL Tween-20，10m L1mol/ L NaOH 溶液，定容至 200 mL，涡旋混合均匀；或采用等效的商品化产品。 7　仪器设备7.1 离心机（离心力≥ 12 000 g）， 4℃±1℃。 7.2 微量移液器（100 µL~1 000 µL，20 µL~200 µL，2 µL~20 µL，0.5 µL ~10 µL ）。 7.3 PCR 仪。 7.4 恒温水浴锅，65 ℃±1℃。 7.5 天平：感量 0.01g 7.6 pH 计。 7.7 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 8   检验步骤 8.1   样品前处理 鲜活成鱼宜取肌肉组织。如需非致死性取样，剪取部分鱼鳍条或者刮去部分皮肤后取皮下一 小块 3mm3~5 mm3的肌肉块即可。其他鱼类制品，例如罐头、寿司等，宜取肌肉组织部分，少有 脂肪组织。 将固状待检样品研磨混匀，分装 3 份，其中 1 份为检样，另外 2 份为留存样品。 加工食品可能富含盐、糖、植物色素和发酵产生的有色物质等，会影响下游实验操作，应通 过洗涤方式尽量去除样品中的盐、糖和色素等杂质。以正式出版文本为准4 SN/T 5742—20238.2 样品 DNA 提取 称取 100 mg 样品于 2 mL 离心管中，加入 1 mL CTAB 提取液，加入 10 μL 20 mg/mL 蛋白酶 K， 65 ℃温育 1 h，期间不时振荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加入适量 CTAB 提 取缓冲液；取出后