SN ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5671—2024 为准 猪圆环病毒 2 型和 3 型荧光PCR 检测方法 X Detection method of fluorescent 2024-12-31发布 2025-07-01实施 中华人民共和国海关总署发布 SN/T 56712024 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国天津海关、韶关学院、中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国 石家庄海关、中华人民共和国大连海关、中华人民共和国成都海关。 本文件主要起草人：陈小金、赵丹、刘立兵、帅江冰、张俊哲、张晓峰、董志珍、张霞、陈世界、王建昌、 肇慧君、王金凤、林华。 以正式出版文本为准 SN/T 5671—2024 猪圆环病毒2型和3型荧光PCR检测方法 1范围 本文件描述了猪圆环病毒2型和3型的实时荧光PCR及数字PCR检测方法。 本文件适用于猪圆环病毒2型和3型的实验室检测。 2规范性引用文件 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 GB19489 实验室生物安全通用要求 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 出版文本为 3.1.1 检测限 limit of determination;LOD 线性动态范围内，数字PCR方法所能检测样品中病毒的最低拷贝数浓度。 3.1.2 定量限 limit of quantification; LOQ 线性动态范围内，平行组相对标准偏差不超过25%的精度条件下，数字PCR方法所能定量测定的 样品中病毒的最低拷贝数浓度。 3.1.3 微反应体系tiny reaction system 将含有模板、引物/探针、Tag酶及其缓冲液充分混匀后分配至体积相同且相互物理隔离的油包水 液滴或其他微孔、微室中所形成的小体积荧光PCR反应体系。 3.1.4 过程质控物质 process control 通过添加与目的病毒类似的外源质控物质，来监测整个检测过程，通过对最终过程质控物质回收率 的计算来评估检测过程的有效性和计算样品中病毒的实际含量。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BC 空白对照（blank control) bp 碱基对（base pair） 1 SN/T 5671—2024 Ct 循环阅值（cyclethreshold） DNA 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) dPCR 数字 PCR(digital PCR) EPC 外源过程质控(external process control) F-PCR 荧光 PCR(fluorescent PCR) NC 阴性对照（negative control) PC 阳性对照（positive control) PCR 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） PCV2 猪圆环病毒2型（porcinecircovirus2） PCV3 猪圆环病毒3型（porcinecircovirus3） qPCR 实时荧光PCR(real-timePCR） 4 仪器和设备 4.1 Ⅱ级生物安全柜。 4.2实时荧光PCR扩增仪。 4.4微量核酸蛋白测定仪。 4.6组织匀浆仪。 4.7 高压灭菌器。 4.8 5试剂和材料 5.1水：符合GB/T6682规定的一级水 5.2灭菌生理盐水：配制应符合A.1的要求， 5.33mol/LNaOAc溶液：配制应符合A.2的要求。 5.4磷酸盐缓冲液（PBS）：配制应符合A.3的要求。 5.5无核酸酶水：配制应符合A.4的要求。 5.6DNA提取试剂：CTAB裂解液、蛋白酶K溶液（20mg/mL）、Tris饱和酚、三氯甲烷、异丙醇、无水 乙醇。 5.72XPCR预混反应液(probe qPCR)。 5.8质控物质：阳性质控品用符合要求或具备一定资格单位提供的含PCV2和PCV3DNA的组织样 品或质粒（序列参考信息见附录B中B.2B.5）；阴性质控品为不含PCV2和PCV3的组织或血液。 5.9# 荧光PCR扩增管或反应板、数字PCR微反应体系生成联排管及覆膜或芯片。 5.10无核酸酶离心管。 5.11 数字PCR反应预混液 5.12 引物和探针：引物探针序列见表1，扩增序列的信息见附录B。 2 SN/T 5671—2024 表1 引物探针序列信息 扩增片 方法 病毒 引物名称 序列 段长度 PCV2-qF（上游引物） GARACTAAAGGTGGAACTGTACC PCV2-qF2（上游引物） CGGGCTGGCTGAACTTTTG PCV2-qR（下游引物） TCCGATARAGAGCTTCTACAGC 118 bp PCV2 PCV2-qR2（下游引物） CCAGGTGGCCCCACAAT 87 bp PCV2-qP（探针） HEX-AGGAGTACCATTCCAACGGGG-BHQ1 PCV2-qP2（探针） HEX-TCACGCTTCTGCATTTTCCCGC-BHQ1 PCV3-qF（上游引物） GGTGAAGTAACGGCTGTGTTTT 实时荧 PCV3-qF2（上游引物） TATAATGGGGAGGGTGCTGT 光PCR PCV3-qR（下游引物） ACACTTGGCTCCARGACGAC 86 bp PCV3 PCV3-qR2（下游引物） CCCCAATTCTCAGCAATTCA 76 bp PCV3-qP（探针） FAM-ATGCGGAAAGTTCCACTCGK-BHQ1 PCV3-qP2（探针） FAM-TGATTTTTATGGGTGGGTTCCATTT-BHQ1 IC-qF（上游引物） TGATGTTACCACAAATGTTGTCTTC 内参基因 IC-qR(下游引物） CCTCTACATCTACCTGCTCAGACA 88 bp IC IC-qP(探针) Cy5-ATTCTACCTTGGGTGTAGTCTCCATGT-BHQ2 PCV2-dF（上游引物） GAARTGGTATYTGGGTGCCC PCV2 PCV2-dR(下游引物） ACTCCGTTGTCCTTGAGATC 133bp PCV2-P(探针） FAM-AGCSAAAGGAACAGATCAGC-BHQ1 PCV3-dF(上游引物） GTGCCGTAGAAGTCTGTCATTC 数字 PCV3 PCV3-dR(下游引物） CAGGACAAAGCCTCTTCTTTTT 133bp PCR PCV3-P(探针) HEX-ATAAATGCTCCAAAGCAGTGCTCC-BHQ1 EPC-F(上游引物) GCGATGGTCTCAACTCAACT 质控基因 EPC-R(下游引物） CAAGGGTGTTCTGTGGTGAA 144bp EPC EPC-P(探针） Cy5-ACCATCGAACATCTTTGCTGTCGC-BHQ2 注1：新合成的引物/探针干粉进行配制时，先将引物/探针贮存管短暂离心，然后开盖加纯水溶解，并稀释至 100umol/L后分装，一20℃避光保存备用。 注2：荧光标记：FAM、HEX、Cy5代表荧光报告基团，BHQ1、BHQ2代表荧光猝灭基团，反应过程中选择相应的 荧光通道，过程质控基因探针Cy5荧光报告基团根据数字PCR仪器换用其他适配基团。 注3：R为含A和G的兼并碱基,Y为含C和T的兼并碱基,S为含C和G的兼并碱基。 采样和制样 6.1 采样 6.1.1 根据GB/T18088确定采样动物数量。 6.1.2 血液样品：通过前腔静脉无菌采血至抗凝管中。 6.1.3 组织样品：无菌采集肺脏、淋巴组织和肾脏等组织样本。 3 SN/T 5671—2024 6.2制样 血液样品无需特殊处理。组织样本称重1g加5mL（质量体积比为1：5)灭菌生理盐水或1mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2）匀浆，匀浆后的样品反复冻融3次备用。 每个待测样本分三等份，分别作为检样、复检样和储存样，样品的制备过程应防止交叉污染和组分 改变，标记后备用或冷冻保存。若样品不能当天检测，应先置于一20℃条件下保存备用，需托运时应确 保冷藏或冰冻状态运输。 6.3 样品检测、保存和废弃物处理 涉及病原检测应在Ⅱ级生物安全实验室进行操作，样品保存和废弃物处理按照GB19489要求 进行。 7实时荧光PCR方法 7.1设立对照 为准 1的样品作阳性对照，用不 含PCV2和PCV3DNA的血液或组织样品作阴性对照，用等体积的超纯水代替模板作为空白对照。 7.2核酸提取 7.2.1裂解消化 取200μL组织匀浆液或血液加 3裂解液和20μL的蛋白酶K，65℃水浴 20min，每隔5min轻轻摇动1次。 7.2.2去除杂质 式出版文 加人等体积Tris饱和酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1），轻轻振荡约10min混合均匀。4℃ 12000r/min离心15min,将上清液转移到新离心管中，加人等体积的三氯甲烷-异戊醇（24：1），轻轻 振荡混匀，于4℃12000r/min离心5min。 7.2.3沉淀DNAL 用移液器轻轻地吸取上清液到新离心管中，加1/10体积的3mol/LNaOAc（pH5.2），加入等体积 的异丙醇轻轻混匀，可见白色絮状DNA。4℃12000r