SN ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5670—2024 饲料中反动物、禽及鱼源性成分液相芯片 检测方法 Suspended bead based detection method for ruminant, poultry and fish ingredients in feed and feedstuff 以正式 2024-12-31 发布 2025-07-01 实施 中华人民共和国海关总署发布 SN/T 5670—2024 前言 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国广州海关、中华人民共和国上海海关、广州维佰生物科技股份有 限公司、中华人民共和国杭州海关。 本文件主要起草人：陈茹、梅明珠、高小博、张强、刘志玲、郭鹏举、伍绮文、段燕喻、林志雄、吴晓薇、 李春红、帅江冰、裘慧。 以正式出版文本为准 SN/T 5670—2024 饲料中反鱼动物、禽及鱼源性成分液相芯片 检测方法 1范围 本文件描述了饲料中反台动物、禽及鱼源性成分检测的液相基因芯片方法。 本文件适用于饲料中反台动物、禽及鱼源性成分的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中,注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括） 舌所有的修改单）适用于 本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 荧光强度中位值 median fluoresence intensity 液相芯片检测仪识别每颗微球的编码号及其表面的荧光强度，检测时，软件根据编码号将微球分 类，对每一类编码号微球取预先设定的数量并按其表面的荧光强度进行排序，取其荧光中位值作为该编 码号微球的检测值，即荧光强度中位值。 3.1.2 阅值 cutoffvalue 判定检测阳性信号的最低荧光强度中位值。 3.2 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 COI:细胞色素氧化酶I(Cytochrome oxidase subunit I) CTAB：十六烷基三甲基漠化铵（Cetyltrithylammoniumbromide） DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonuleic acid) dimide hydrochloride EDTA：乙二胺四乙酸(Ethylene diaminetetraacetic acid) HPLC:高效液相色谱（High-performanceliquid chromatography） 1 SN/T 5670—2024 MES:2-(N-吗啡基)乙磺酸[2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid」 MFI：荧光强度中位值（Medianfluoresenceintensity） PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamidegelelectrophoresis） PCR：聚合酶链式反应（Polymerase chainreaction） rRNA：核糖体核糖核酸(Ribosomal ribonucleic acid) SAPE：链霉亲和素枣红蛋白（Streptavidin-phycoerythrin） SDS：十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate） Taq：水生栖热菌（Thermusaquatic) TMAC:氯化四甲基胺(Tetramethylammonium chloride) 4技术原理 液相芯片技术以直径约6um的微球为基质进行检测分析。微球悬浮于液相体系中，构成液相芯 片检测系统，液相基因芯片检测方法通过基于微球的核酸杂交技术并联合流式细胞技术，对样品中的靶 探针，按碱基配对原理与样品核酸的扩增产物特异结合，事先通过采用标记引物使扩增产物带有生物素 基团；使杂交产物与SAPE进行反应产生报告荧光，随后利用液相芯片检测仪对微球进行荧光编码识 别和荧光反应信号检测。 本文件采用液相基因芯片检测方法原理，分别以反台动物线粒体基因组中的16SrRNA、禽线粒体 基因组中的COI基因、鱼线粒体基因组中的12SrRNA保守区为靶标，采用反台动物通用引物和探针 （覆盖黄牛、水牛、牦牛、绵羊、山羊、鹿、骆驼）禽通用引物和探针（覆盖鸡、鸭、鹅、鸽、火鸡、鹑、鹧鸪） 和鱼通用引物和探针，进行反台动物、禽及鱼共3大类动物源性成分的检测鉴定，但不区分每种大类内 具体物种。采用三重液相芯片方法，可实现同步鉴别检测反台动物、禽及鱼源性成分。 5设备与耗材 5.1 液相芯片检测仪。 5.2 PCR仪。 5.3 台式高速冷冻离心机：离心速度不低于12000r/min。 5.4 超净工作台。 5.5 涡旋振荡仪， 5.6 超声仪。 5.7 恒温混匀仪。 5.8 3机械搅拌器、均质仪，或研磨装置。 5.9 天平：感量0.1mg。 5.10 微量核酸蛋白分析仪，或紫外分光光度计。 5.11 摇床。 5.12 磁力架。 5.13 聚苯乙烯微孔板。 5.14 可调微量移液器及带滤芯吸头：0.5μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、200μL～ 1 000 μL. 2 SN/T 5670—2024 5.15 微量离心管：1.5mL。 5.16 PCR反应管。 6 试剂 6.1 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。试验用水符合GB/T6682中二级水的要求。 6.21 微球：采用羧基化非磁性微球（MicroPlexbeads），或羧基化磁性微球（MagPlexbeads）。 6.3 扩增引物和探针。各条下游引物的5'端均标记生物素（biotin），HPLC纯化；各条探针的5'端均 C12标记氨基（AmM），HPLC纯化；上游引物采用PAGE纯化。反台动物、禽和鱼源性成分特异扩增 引物和探针序列见表1。采用无核酸酶超纯水将每条引物配制成100μmol/L储存液，置一20℃以下 冻存，使用时，根据表2，取适量配制成5umol/L或10umol/L工作液，避免多次冻融。用无核酸酶超 纯水将每条探针配制成100umol/L溶液，直接使用，剩余探针液置一20℃以下冻存，避免多次冻融。 表1扩增引物与探针序列 类别 引物探针序列(5'-3')与标记 上游引物 Rum F:TGGTTGTCCAGAAAATGA 反台动物 下游引物RumR:biotin-TGTACCTTTTTAGACTAACTT 探针：AmM C12-TTCAGCTTTAAA(G/A)ATACCAAAA 上游引物AviF1:CTAACAGGAATCGTCCTTGC 上游引物 Avi F2:CTAACAGGAATTGTCCTCGC 禽 下游引物AviR：biotin-GTGAATCCTGCTAGGATGGC 探针 :AmM C12-GTAGTCGCCCACTTCCACTA 上游引物 Fis F:AGGAGCCTGTTCTAGAAC 鱼 下游引物 Fis R:biotin-TTCACAGGGTAAGCTGAC 探针:AmM C12-TTTTTTTTTTTTCCCCGTTAAACCTCACC 6.4 热启动TaqDNA聚合酶。可采用PromegaGoTaqHotStartPolymerase'"或其他等效产品。 6.5 无核酸酶超纯水。 6.6 无水乙醇。 6.7 MES溶液：配制方法按附录A中A.1。 6.8 TMAC溶液：1.5XTMAC配制方法按A.2，1XTMAC配制方法按A.3。 6.9 EDC溶液：配制方法按A.4。 6.10 0.02%Tween-20：配制方法按A.5。 6.11 0.1%SDS：配制方法按A.6。 6.12 TE缓冲液：配制方法按A.7。 6.13 SAPE。 可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 3 SN/T5670—2024 7检测步骤 7.1样品预处理 液态样品、粉状样品，可直接用于核酸提取纯化。肉类等动物组织、罐装或冷冻肉类宠物食品，取约 50g，用机械搅拌器或研磨仪进行粉碎或研磨，处理成粉状，密封冷藏备用。 7.2DNA提取 7.2.1DNA提取方法选择 推荐根据不同的样品基质类型，选择适宜的DNA提取方法或试剂盒 7.2.2饲料DNA的试剂盒提取方法 7.2.2.1本文件以适用于基质成分较复杂的饲料产品的试剂盒为例（试剂盒组成及说明见附录B)。 7.2.2.2称取50mg预处理好的样品，加人320uL裂解缓冲液GA，振荡至彻底悬浮，加人20uL蛋白 酶K溶液，振荡混匀，65℃放置20min～30min，其间混匀2次～3次。 7.2.2.3加入340μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，65℃放置10min，其间混匀2次～3次。 7.2.2.412000r/min离心2min，取440μL上清至新离心管中，加人220μL无水乙醇，充分颠倒混匀 6次~8次。 7.2.2.5将所有溶液加入吸附柱CB3中，吸附柱放人收集管中，12000r/min离心2min，倒掉废液，将 吸附柱CB3放回收集管中。 7.2.2.6加500μL缓冲液GD至吸附柱CB3中，12000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回 收集管中。 7.2.2.7加600μL漂洗液PW至吸附柱CB3中，12000r/min离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放 回收集管中。 7.2.2.8重复7.2.2.7操作步骤。 7.2