ICS11.220 CCSB41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5668—2023 水禽圆环病毒感染检疫技术规范 Technicalspecificationforcircovirusinfectioninwaterfowls 2023-12-29发布 2024-07-01实施 中华人民共和国海关总署发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国福州海关、福建省农业科学院畜牧兽医研究所、厦门市翰均科检 测科技有限公司、中华人民共和国石家庄海关。 本文件主要起草人:郑腾、傅光华、张体银、施少华、张志灯、黄瑜、王武军、程龙飞、王建昌、谢向机、 陈翠腾、黄素文、万春和、傅秋玲、姜焱、陈红梅、刘荣昌、陈珍、江南松。 ⅠSN/T5668—2023水禽圆环病毒感染检疫技术规范 1 范围 本文件规定了水禽圆环病毒感染的临床诊断、聚合酶链式反应检测和实时荧光聚合酶链式反应检 测要求。 本文件适用于水禽圆环病毒感染(鸭圆环病毒感染和鹅圆环病毒感染)的监测、检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct:每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数(Cyclethreshold) DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid) dNTP:三磷酸脱氧核苷酸(Deoxynucleosidetriphosphate) DuCV:鸭圆环病毒(Duckcircovirus) EB:溴化乙锭(Ethidiumbromide) GoCV:鹅圆环病毒(Goosecircovirus) PCR:聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction) 5 疫病概述 水禽圆环病毒感染是近年来倍受关注的新发现传染病之一,该病流行十分广泛,宿主谱广,不同品 种、不同日龄的水禽均有报道,以生长迟缓、羽毛紊乱、体况消瘦为主要临床特征。水禽圆环病毒属于圆 环病毒科圆环病毒属,基因组为单链环状DNA,主要包括鸭圆环病毒(Duckcircovirus,DuCV)和鹅圆 环病毒(Goosecircovirus,GoCV)。该病毒主要侵害水禽的淋巴网状内皮组织,引起淋巴器官(特别是 法氏囊)淋巴细胞减少,免疫力下降,导致宿主对其他病原(如大肠杆菌、巴氏杆菌或禽流感,鸭甲肝病毒 及水禽细小病毒等)二次感染的易感性增加,影响其他疫病病原疫苗的免疫效果。GoCV最早于1999年在 发病鹅中被发现,DuCV于2003年首次在患病鸭中被发现。我国自2005年和2008年首次分别报道了 1SN/T5668—2023GoCV和DuCV在水禽中出现以后,各地饲养的水禽均陆续出现感染报道。GoCV核酸阳性率达 35.4%,种鹅群GoCV血清阳性率在60.0%~90.9%,鸭群DuCV阳性率则在10%~81.6%。值得关注 的是,目前已有在患病鹅中检测到DuCV的报道,说明两种水禽圆环病毒还存在交叉感染现象。 6 临床诊断 6.1 临床症状 感染圆环病毒的水禽可以出现以下症状: a) 水禽群体内个体间生长参差不齐,感染水禽体况消瘦,体重与同日龄未感染健康水禽差异 明显; b) 羽毛杂乱,易脱落,严重的出现背脊或翅尖羽毛完全脱落。 6.2 病理变化 6.2.1 剖检变化 水禽感染圆环病毒一周以后主要免疫器官开始出现以下变化: a) 胸腺出血或萎缩; b) 法氏囊萎缩; c) 脾脏萎缩。 6.2.2 组织学变化 组织学变化如下: a) 法氏囊淋巴滤泡结构消失,淋巴细胞显著减少; b) 胸腺淋巴细胞显著减少,细胞核出现碎裂和空泡化; c) 脾脏红髓和白髓边界消失,白髓淋巴细胞减少。 6.3 初步诊断 当水禽出现以上临床症状,结合病理变化,可初步诊断为疑似水禽圆环病毒感染,需要进一步进行 实验室检测。 7 仪器和设备 7.1 梯度PCR扩增仪。 7.2 实时荧光PCR仪。 7.3 台式冷冻离心机(转速不低于12000r/min)。 7.4 微量移液器(0.5μL~10μL,2μL~20μL,20μL~200μL,100μL~1000μL)。 7.5 组织匀浆器。 7.6 电泳仪。 7.7 电泳槽。 7.8 紫外凝胶成像系统。 7.9 冰箱(2℃~8℃和-70℃)。 2SN/T5668—20238 试剂、引物和探针 8.1 水:符合GB/T6682中二级水的规格。 8.2 蛋白酶K。 8.3 10%十二烷基磺酸钠(SDS):配制方法按附录A中A.1。 8.4 Tris饱和苯酚。 8.5 酚∶三氯甲烷∶异戊醇(25∶24∶1)。 8.6 3mol/L的醋酸钠溶液:配制方法按A.2。 8.7 无水乙醇。 8.8 75%乙醇:配制方法按A.3。 8.9 溴化乙锭溶液:配制方法按A.4。 8.10 1×TAE缓冲液:配制方法按A.5。 8.11 1.0%琼脂糖凝胶:配制方法按A.6。 8.12 DNA分子量标准物:100bp~2000bp。 8.13 10×加样缓冲液:配制方法按A.7。 8.14 普通PCR引物: 检测DuCV、GoCV共有上游引物F1:5'-AAYCWCGCGGGAAGTGGTGGGA-3'; 检测DuCV的下游引物R1:5'-TTCTARGCATAAACGAGATC-3'; 检测GoCV的下游引物R2:5'-ATAMGATTCGGACAATGGACTG-3'。 引物序列中的简并碱基Y表示C或T,W表示A或T,M表示A或C,R表示A或G,F1与R1用 于检测DuCV,扩增条带为554bp大小的基因片段,F1与R2用于检测GoCV,扩增条带为407bp大小 的基因片段。各引物的工作浓度均为10μmol/L,保存于-20℃备用。 8.15 荧光PCR引物和探针。 8.15.1 检测鸭圆环病毒的SYBRGreenⅠ荧光PCR检测引物: 上游引物DuCV-F:5'-GGCGAAGAGCGGCAACTA-3'; 下游引物DuCV-R:5'-CCGACGATAGCGAACTTGC-3'。 扩增片段约123bp,用水溶解至10μmol/L后,保存于-20℃备用。 8.15.2 检测鹅圆环病毒荧光PCR检测引物和探针: 上游引物GoCV-F:5'-AGGTAATGGTTGCTTCTACTGTTAG-3'; 下游引物GoCV-R:5'-GTGGTATTCTACGGAATGGGTATG-3'; 探针为GoCV-p:5'-ACAAGCCGARGACACCGCAGCACC-3'。 引物序列中的简并碱基R表示A或G,探针GoCV-p其5末端标记荧光报告基团FAM,3末端标 记荧光淬灭基团Eclipse,扩增片段约82bp,用水溶解至10μmol/L后,保存于-20℃备用。 9 样品的采集与处理 对生长不良、羽毛紊乱、体况消瘦或发病的水禽,按NY/T541—2016的要求无菌采集水禽的法氏 囊、脾脏等器官合并进行检测。采集的器官剪碎后与磷酸盐缓冲液(PBS,按A.8)按体积比1∶5的比例 制成组织匀浆液,反复冻融3次,8000r/min离心30min,取上清,用于DNA抽提,或置-20℃条件下 冻存备用。 对被检水禽,以棉拭子分别采集咽喉和泄殖腔分泌物合并进行检测。以无菌棉拭子在咽喉或泄殖 腔内来回刮取3次后,合并放置于2mL含抗生素的磷酸盐缓冲液中,用于DNA抽提,或置-20℃冻 3SN/T5668—2023存备用。 若采集的样品需放置6h后再进行处理,应先置-20℃条件下保存备用,应在冷冻状态下运输。 10 水禽圆环病毒聚合酶链式反应 10.1 设立对照 分别以已知阳性样品作为阳性对照。以已知阴性样品作为阴性对照。以水作为空白对照。 10.2 DNA的提取 10.2.1 取540μL匀浆上清液或棉拭子浸出液,加入60μL10%的SDS,再加入蛋白酶K至终浓度 5mg/mL,充分混匀15s,56℃水浴2h。 10.2.2 加入等体积Tris饱和苯酚,充分混匀15s,4℃下12000r/min离心15min。 10.2.3 取离心后上清液加入等体积酚∶三氯甲烷∶异戊醇(25∶24∶1),颠倒混匀15s,静置5min 后,在4℃下12000r/min离心15min。 10.2.4 重复10.2.3步骤1次。 10.2.5 取离心后的上清液加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液(pH为5.2)、2.5倍体积的无水乙 醇,颠倒混匀15s,-20℃沉淀2h。 10.2.6 随后在4℃下12000r/min离心15min。轻轻倾去上清液,加入800μL75%乙醇清洗沉淀 2次,瞬时离心后,吸尽残余液体,室温静置5min。 10.2.7 加入50μL水重悬,轻轻混匀溶解管壁上的DNA,冰上保存备用。提取的DNA应在2h内进 行PCR扩增或保存于-20℃条件下。 注:DNA提取也能选用等效的商品化试剂盒。 10.3 PCR反应操作 10.3.1 PCR反应液配制 在0.2mLPCR反应管中,按表1配制反应体系,加样宜