ICS07.080 CCSB43 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5667—2024 哺乳动物物种鉴定方法 测序法 Mammalianspeciesidentificationmethod—Sequencingmethod 2024-12-31发布 2025-07-01实施 中华人民共和国海关总署发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国上海海关、上海科技大学、上海动物园。 本文件主要起草人:蔡一村、宋蓉蓉、王艳、王瑛、林颖峥、冯之航、刘群秀、薛俊欣、张强、熊炜、李树清、 潘良文、李健、袁耀华、赵简。 ⅠSN/T5667—2024哺乳动物物种鉴定方法 测序法 1 范围 本文件描述了哺乳动物物种成分双脱氧法(Sanger)和高通量测序鉴定方法。 本方法适用于哺乳动物的毛、皮、肉、血、骨、体液等单一或混合来源的动物及动物制品物种成分定 性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T30989—2014 高通量基因测序技术规程 GB/T35918—2018 动物制品中动物源性检测基因条码技术 Sanger测序法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 序列相似性 sequencesimilarity 反映序列间相似程度的数值,是判定同源性关系的依据。 注:序列间相似度越高,提示两序列间同源可能性越高。 3.2 序列比对 sequencealignment 将待测序列与DNA序列库进行比较。 3.3 Sanger测序法 sangersequencing 双脱氧链终止法,以单链或双链DNA为模板,在DNA聚合酶的催化下延伸结合在模板上的引 物,直到掺入一种链终止核苷酸为止。每个反应含有4种dNTP,并混入用同位素或荧光标记的 ddNTP,使延长的寡聚核苷酸选择性终止,通过高分辨率变性毛细管电泳分离片段获得碱基顺序的 方法。 3.4 高通量测序 high-throughputgenesequencing 区别于传统Sanger(双脱氧法)测序,能一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定的技术。 注:通常一次测序反应能产出不低于100Mb的测序数据。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件: 1SN/T5667—2024BLAST:基于局部比对算法的搜索工具(basiclocalalignmentsearchtool); DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid); EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid); NCBI:美国生物技术信息中心(Nationalcenterforbiotechnologyinformation); PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction); RNA:核糖核酸(ribonucleicacid); SDS:十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate)。 5 试剂和材料 除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。试验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均 使用无DNA酶污染的容器存储或分装。 5.1 DNA提取试剂 5.1.1 0.5mol/L(pH8.0)EDTA溶液。 5.1.2 裂解液,配制方法见附录A。 5.1.3 苯酚。 5.1.4 三氯甲烷与异戊醇混合液(按24∶1的比例混合)。 5.1.5 蛋白酶K(20mg/mL)。 5.1.6 75%乙醇。 5.2 PCR扩增试剂 5.2.1 上游引物:序列5'-TAA-GAC-GAG-AAG-ACC-CTR-TGG-A-3'。 5.2.2 下游引物:序列5'-CGG-TCT-GAA-CTC-AGA-TCA-CGT-3'。 注:上游引物为简并引物,R=A/G。 5.2.3 用去离子水将每条引物配制成100μmol/L储存液,置-20℃以下冻存;使用时取适量配制成 10μmol/L工作液,避免反复冻融。 5.2.4 MasterMix(2×) 5.2.5 去离子水,应符合GB/T6682的要求。 5.3 凝胶电泳试剂 5.3.1 琼脂糖电泳相关试剂。 5.3.2 GelRed核酸染料。 5.3.3 核酸标准分子质量Marker:推荐使用可以判定350bp左右片段大小的DNAmarker。 6 仪器和设备 6.1 超净工作台。 6.2 电子天平,分度值0.1mg。 6.3 微量移液器。 6.4 高速台式冷冻离心机。 6.5 NanoDrop微量核酸蛋白测定仪。 6.6 PCR仪。 2SN/T5667—20246.7 水平电泳仪。 6.8 凝胶成像分析系统。 6.9 测序仪。 7 检测步骤 7.1 核酸提取 7.1.1 对于哺乳动物的毛、皮、肉、骨及其相关的固体样品,应充分研磨后取20mg作为被提取物;对于 液体样品,如血液、精液、组织匀浆液等应充分振荡混匀,取50μL作为被提取物。置于1.5mL离心 管中。 注:骨骼牙齿等样品要进行适当脱钙处理。使用0.5mol/L(pH8.0)EDTA溶液对样品碎屑37℃孵育过夜,离心 去上清。 7.1.2 加入600μL裂解液(见A.1)和20μL蛋白酶K溶液(见A.2),混匀,置56℃水浴1h(期间每 15min轻微振动混匀)或过夜。 7.1.3 待消化完全,冷却至室温,加入200μL乙酸铵溶液(见A.3),混匀,4℃冷却5min~10min,使 蛋白质析出。 7.1.4 使用4℃,12000r/min(约13400g)离心10min,上清液转移至另一个1.5mL离心管中,于 4℃,12000r/min(约13400g)离心10min,取上清液至另一个洁净1.5mL离心管中,加等体积三氯 甲烷与异戊醇混合液,轻轻摇匀,4℃放置15min。 7.1.5 4℃12000r/min(约13400g)离心10min沉淀DNA;弃上清,加1mL75%乙醇,轻轻混 匀,于4℃12000r/min(约13400g)离心5min,弃上清,晾干;干燥后加入50μL去离子水溶解; DNA样品置冰上备用,若需长期保存应置于≤-20℃保存。 注:也能采用经验证等效的商业化DNA提取纯化方法或试剂盒进行核酸提取纯化,具体参照说明书使用。 7.2 DNA浓度和纯度的测定 吸取DNA提取液1μL,以去离子水作为空白对照,使用微量核酸蛋白测定仪测定DNA模板的质 量浓度及A260/A280比值。DNA的质量浓度根据式(1)计算: DNA的质量浓度(ng/μL)=A260×50×稀释倍数…………………(1) 提取的DNA质量浓度要求大于或等于5ng/μL,A260/A280的比值在1.7~1.9之间。不达标应重 新提取核酸。 7.3 对照和平行设置 检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照、空白对照。用已知含哺乳动物成分的样品作阳性对 照,用已知植物样品核酸作阴性对照,用等体积的双蒸水代替模板作为空白对照。 7.4 PCR反应体系 在冰上配置50μL反应体系,见表1。 3SN/T5667—2024表1 PCR反应体系 试剂 工作液浓度 加样量/浓度 MasterMix 2× 25μL primer-F 10μmol/L 2μL(10μmol/L) primer-R 10μmol/L 2μL(10μmol/L) DNA模板 — 1μL~5μL(20ng/μL~100ng/μL) 去离子水 — 补足50μL体系 注:最终反应体系中试剂添加的种类和总体系体积可能会根据不同的PCR试剂产生差异。进行不同体系配置 时,需参照不同试剂使用说明书。 7.5 反应程序 将已加样的PCR反应管短暂离心后放入PCR仪,扩增反应条件设定:95℃预变性2min;95℃变 性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,40个循环;72℃5min;4℃保存。 注:根据不同PCR酶的要求,对反应程序中循环(扩增)步骤进行相应等效修改。 7.6 琼脂糖电泳 用1×TAE电泳缓冲液配制含0.1μL/mLGelRed的2%琼脂糖凝胶。取5μL扩增产物点样后进 行电泳检测,设DNAMarker进行同步电泳;采用120V电压,电泳30min,用凝胶成像仪或紫外透射 仪观察,拍照记录结果。不同物种扩增出的目的条带大小在350bp左右略有变化。 7.7 测序 7.7.1 将阳性扩增产物进行测序。 7.7.2 针对单一物种样品使用Sanger测序法采集扩增产物序列遗传信息。具体试验参照GB/T35918— 2018进行。 7.7.3 针对混合物种样品使用高通量测序技术对扩增产物序列遗传信息进行同时采集。具体试验参 照GB/T30989—2014进行。 注:建议送专业测序公司完成测序试验。 7.8 序列比对 Sanger测序和高通量测序采集的序列信息,使用BLAST程序与NCBI数据库中的物种序列信息 进行比对。具体分析步骤参照附录B和附录C进行。 8 结果判断与表述 8.1 有效性原则 以下条件需要同时满足,否则本次试验不成立: ———空白对照:无特异性条带; ———阴性对照:无特异性条带; ———阳性对照