SN ICS 11.220 CCS B 40 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5666—2024 软骨鱼类物种鉴定技术规范 Technical specifications for identification of chondrichthyes 以正式出版 2024-12-31发布 2025-07-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T 5666—2024 前 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国北京海关、中华人民共和国武汉海关、中国海洋大学、中国海关科 本文件主要起草人：刘艳华、郑剑、康斌、张利峰、高隆英、曾宪东、唐泰山、郑晓聪 、于力、史秀杰、 吴义诚。 以正式出版文本为准 SN/T5666—2024 软骨鱼类物种鉴定技术规范 1范围 本文件规定了软骨鱼物种的形态学和基因条形码鉴定技术，及其制品的软骨鱼成分基因条形码鉴 定技术。 本文件适用于软骨鱼物种的鉴定，以及软骨鱼制品成分的鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T35918 动物制品中动物源性检测基因条码扌 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 尾常为歪型尾，无，肠内具螺旋瓣。雄性具有鳍脚，体内受精。 3.2 全头亚纲holocephali 软骨鱼纲中的亚纲。体常光滑，无鳞，胸鳍宽大，尾鳍细长，雄性具交接器。鳃裂4对，外被一膜状 鳃盖，后具一总鳃孔。背鳍硬棘能竖垂。雄性除具鳍脚外，还具1对腹前鳍脚和1个额鳍脚。尾歪形、 圆形或线形。 3.3 板鳃亚纲elasmobranchii 软骨鱼纲中的亚纲。体长形,披盾鳞。鳃隔发达呈板状。鳃裂5对7对，各自单独开口于身体表 面，无鳃盖褶。背鳍上的硬棘不能自由竖立。口位于头部吻的腹面，宽大而横裂大多数眼后有喷水孔1 个。皮肤鳍条为角质鳍条，歪尾形，不具。体被盾鳞。含鲨形总目和鳐形总目。 3.4 濒危物种endangered species 列入《濒危野生动植物物种国际贸易公约》附录以及国家和地方重点保护名录的物种。 3.5 盾鳞placoid scale 软骨鱼类所特有的鳞片，由棘突和基板两部分组成，呈对角线排列 1 SN/T 5666—2024 3.6 鳃（裂）孔gill slits 鱼类咽部两侧一系列成对的裂缝，直接与外界相通。 3.7 歪形尾 heterocercal tail 脊柱尾端向上弯，尾鳍上下两叶不对称，上叶狭小下叶宽大。 3.8 鳍脚clasper 软骨鱼类雄性交配器官。多位于腹鳍内侧，是一对棒状结构，内有软骨支持。 注：个别种类还具有腹前鳍脚或额鳍脚。 3.9 鳍fin 鱼类体上的外部器官，内有附肢骨骼支持，通常分布在躯体和尾部上，是主要的运动和平衡身体的 工具。 注：鳍一般可分为两类，一类是不成对的奇鳍，位于背部、尾部和肛门后，包括背鳍、尾鳍和臀鳍；另一类是左右成对 的偶鳍，位于体之两侧，包括胸鳍和腹鳍， 3.10 喷水孔spiracle 3.11 DNA条形码 DNAbarcode 3.12 Sanger 测序法Sanger sequencing 以单链或双链DNA为模板，在DNA聚合酶的催化下延伸结合在模板上的引物直到掺入一种链 终止核苷酸为止。每个反应含有四种dNTP,并混人用荧光标记的ddNTP,使延长的寡聚核苷酸选择 性终止，通过高分辨率变性毛细管电泳分离片段获得碱基顺序的方法 3.13 质量评分 quality value 仪器测序过程中，软件分析测序信号时，根据预测到的碱基解读错误率，给出针对每个碱基所对应 的质量评分，用以评估单个碱基的测序质量。 3.14 不可信区域 unreliable area 测序结果序列两端QV值低而不作为结果分析的区域。 3.15 序列相似度similarityof the sequences 反映序列间相似程度的数值。 注：一般以百分数表示。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BOLD：生物条形码数据系统(Barcodingof LifeData System) 2 SN/T 5666—2024 CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（CetyltrithylammoniumBromide) ddNTP：双脱氧核糖核苷三磷酸（DideoxyribonucleosideTriphosphate) DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid) dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸(DeoxyribonucleosideTriphosphate) EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylene Diaminetetraacetic Acid) NCBI：美国国家生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation) QV：质量评分（QualityValue） PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction） RNA:核糖核酸(Ribonucleic Acid) Tris：三羟甲基氨基甲烷(Tris hydroxymethyl Aminomethane) 5 试剂和材料 3/T6682规定一级 5.1 二水乙二铵四乙酸二钠。 5.2 三羟甲基氨基甲烷。 5.3 十六烷基三甲基溴化铵。 5.4 冰乙酸。 5.5 氯化钠。 5.6 无水乙醇。 5.7 蛋白酶K。 5.8 三氯甲烷。 5.9 异戊醇。 5.10 5.11 dNTPs(2.5 mmol/L,含 dATP、dTTP、dGTP、dCTP)。 5.12 高保真 DNA 聚合酶(5 U/μL)。 5.13 琼脂糖(电泳纯)。 5.14 TAE电泳缓冲液 5.15 分子量标准品（100bp～2000bp）。 5.16 EB或EB替代染液。 5.17 PCR反应管：200μL。 5.18 Eppendorf离心管：1.5mL。 5.19 检测用引物序列见表1,将引物用去离子水稀释为10μmol/L，一20℃保存备用。 表 1引物序列 目标基因 引物名称 引物序列5'-3° 扩增片段长度 FISHCOILBC_ts CACGACGTTGTAAAACGACTCAACYAATCAYAAAGATATYGGCAC COI 700bp左右 FISHCOIHBC_ts GGATAACAATTTCACACAGGACTTCYGGGTGRCCRAARAATCA M13F（-29) CACGACGTTGTAAAACGAC 测序引物 M13R GGATAACAATTTCACACAGG 3 SN/T 5666—2024 6设备 6.1 解剖刀、解剖剪、解剖针、解剖镊。 6.2 量鱼板。 6.3 放大镜和显微镜。 6.4 普通PCR仪。 6.5 ：电泳仪。 6.6 凝胶分析成像系统。 6.7 电子天平（感量0.001g）。 6.8 冷冻离心机。 6.9 水浴锅。 6.10 微量加样器:（0.1 μL～2.5μL,2μL～20 μL,20 μL～200μL,100μL～~ 6.11 超纯水仪。 6.12 漩涡振荡器。 6.13 微量核酸定量仪。 6.14 pH计。 6.15 粉碎研磨装置。 6.16 恒温加热器。 实验室基本要求和防污染措施 染的措施按照LY/T2501、GB/T27403中的规定 执行。 8 鉴定原则 8.1样品形态特征完整、明确的，可采用形态学方法进行鉴定。 8.2形态学方法无法进行鉴定的，可采用基因条形码方法进行鉴定 8.3形态学方法中具有唯一性的特征指标可以单独使用，如指标特征不具有唯一性，联合使用2个以 上指标作出鉴定结论 8.4必要时，可结合形态学方法和基因条形码检测方法进行综合判定 9 形态学鉴定方法 9.1 测量和观察下列（但不限于）各形态特征指标(示意图见附录A)： a) 头型：头长、头宽、头高； b) 体型：体长、体宽、体高； c) 尾型：正尾形、歪尾形（上叶长、下叶长）； d) 口：形状、位置、口裂长、口裂宽、口裂高； e) 眼：位置、眼径、眼间距； f) 鳃孔：数量、位置； g) 鼻口沟：有或无； 4 SN/T56662024 h）齿：位置、形状、数量； i）鳍：种类、位置与大小，背鳍是否具鳍棘，胸鳍前缘是否游离； j）鳍脚：腹前鳍脚、额鳍脚，鳍脚是否分枝。 录B），对样品进行物种鉴定。 10基因条形码鉴定方法 10.1样品制备 10.1.1样品采集 10.1.1.1 如取样后样品需继续存活，剪取部分胸鳍或腹鳍的鳍线和膜 10.1.1.2整鱼，冰鲜和冷冻的组织等未进行深加工的样品，取样首选肌肉组织，也可取心、脑、肝、脾、 肾、肠等其他器官组织。 10.1.1.3深加工样品尽量取含鱼组织的部分。 10.1.1.4组织样本应用镊子和手术刀或剪刀取样，每个样本处理后应对取样工具进行火焰消毒，或更 换新的干净工具。每个样本取样后应装于无菌容器并做好标记，避免样本间交叉污染。如不能立即进 行核酸提取，组织样本应置于一20℃冷冻保存或于阴凉处保存在新配制的95%乙醇中，需长期保存的 样本应储存在一80℃。 10.1.2 样品处理 版 10.1.2.1活体取样组织：将采集组织用研磨设备磨碎，留研磨后样本备用。 10.1.2.2初加工样本：取适量样品用研磨设备磨碎，留研磨后样本备用。 离心1