ICS11.220 CCSB41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5665—2023 鲁氏耶尔森氏菌检测技术规范 QuarantineprotocolforYersiniaruckeri 2023-12-29发布 2024-07-01实施 中华人民共和国海关总署发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国深圳海关动植物检验检疫技术中心、中华人民共和国黄埔海关技 术中心、中华人民共和国福州海关、中华人民共和国天津海关、中华人民共和国武汉海关、华中农业 大学。 本文件主要起草人:王津津、陈兵、陈进会、吴江、刘荭、王乃福、史秀杰、于力、杨俊兴、郑晓聪、 王武军、陈孝宇、任向阳、麦晨、秦智锋。 ⅠSN/T5665—2023鲁氏耶尔森氏菌检测技术规范 1 范围 本文件描述了鱼类鲁氏耶尔森氏菌的分离培养、聚合酶链式反应和生化鉴定方法。 本文件适应于鱼类鲁氏耶尔森氏菌的实验室检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088 出入境动物检疫采样 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BHIA:脑心浸出液琼脂(Brainheartinfusionagar); DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid); dNTPs:脱氧核糖核苷酸三磷酸(Deoxynucleotidetriphosphates); EB:溴化乙锭(Ethidiumbromide); PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphatebufferedsaline); PCR:聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction); TSA:胰蛋白胨大豆琼脂(Tryptonesoyagar)。 5 概述 鲁氏耶尔森氏菌(Yersiniaruckeri)属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae),耶尔森氏菌属(Yersinia),是一 种能够引起水生动物,特别是冷水鱼类和温水鲤科鱼类发生肠炎红嘴病(Entericredmouth,ERM)的条件 性致病菌。由该菌引起的疾病的临床症状、流行病学等见附录A。 6 试剂和材料 6.1 胰蛋白胨大豆琼脂(TSA),见附录B中B.1。 6.2 脑心浸出液琼脂(BHIA),见B.2。 1SN/T5665—20236.3 氧化酶试剂,见B.3。 6.4 革兰氏染色液,见B.4。 6.5 磷酸盐缓冲液(PBS),见B.5。 6.6 商品化的生化鉴定试剂盒。 6.7 水:用于PCR(包括核酸抽提)的水要用DEPC处理,以除去DNA酶和RNA酶。其余用水应符合 GB/T6682一级水的规格。 6.8 Taq酶:-20℃保存,避免冻融或温度剧烈变化。 6.9 dNTPs:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L。 6.10 PCR引物的设计是基于鲁氏耶尔森氏菌的16SrRNA基因的部分序列,浓度为20μmol/L,序列 如下: YER3:5'-CGAGGAGGAAGGGTTAAGT-3'; YER4:5'-AAGGCACCAAGGCATCTCT-3'; 扩增片段大小587bp。 7 仪器和设备 7.1 剪刀和镊子。 7.2 培养皿。 7.3 恒温培养箱。 7.4 普通冰箱和超低温冰箱。 7.5 显微镜。 7.6 离心机和离心管。 7.7 微量移液器及吸头。 7.8 PCR扩增仪。 7.9 电泳仪或全自动毛细管电泳仪。 7.10 紫外观察灯或凝胶成像仪。 7.11 全自动微生物鉴定系统。 7.12 组织匀浆机或无菌研钵。 7.13 生物安全柜。 7.14 恒温水浴锅。 7.15 涡旋振荡器。 8 样品处理 8.1 采样 8.1.1 按GB/T18088的规定采样。 8.1.2 无临床症状的鱼,无菌采集其肾、肝、脾等。 8.1.3 对于体表有临床症状的鱼,可采取其病灶深处的组织。 8.2 处理 8.2.1 用于分离培养的样品,直接将采集的组织用无菌接种环接种培养基。 8.2.2 用于PCR检测的样品,将采集的组织置于无菌离心管中,加入5倍体积灭菌PBS(见B.5),使用 组织匀浆机充分匀浆1min~2min(如无组织匀浆机,则将样品放入无菌研钵中充分研磨),然后将制 2SN/T5665—2023备好的组织悬液在4℃8000g离心10min,取上清液转入另一无菌离心管中,备用。 9 核酸检测方法 9.1 核酸抽提 将处理好的组织样品或者疑似为鲁氏耶尔森氏菌的细菌分离物加到含有20μL蛋白酶K(见B.6) 和180μL缓冲液(见B.7)的1.5mL离心管中,上下颠倒混匀,将匀浆液置于56℃水浴,水浴1h~3h;向 匀浆液中按1∶1比例加入酚/三氯甲烷/异戊醇混合液(见B.8),上下颠倒混匀,12000g离心5min;转 移上层水相,加入等体积三氯甲烷/异戊醇混合液(见B.9),上下颠倒混匀,12000g离心5min;转移上 层水相,加入两倍体积的无水乙醇,-20℃放置30min至过夜;14000g离心15min,沉淀DNA,倾去 上清液;于沉淀中加入75%乙醇溶液500μL,轻轻混匀后14000g离心15min,倾去上清液,室温晾干; 用30μL灭菌双蒸水溶解DNA沉淀,冰上保存备用。若需长期保存,应放置在-20℃保存。 也可使用等效的商品化试剂盒抽提核酸。 9.2 PCR扩增 在PCR管内,加入10×PCRBuffer(不含Mg2+)5μL、25mmol/L的MgSO45μL、5U/μLTaq DNA聚合酶1μL、20μmol/L的引物对,YER3/YER4各1μL、10mmol/LdNTPs1μL、样品核酸 5μL、补充灭菌水至50μL。 94℃预变性2min;之后94℃变性40s,60℃退火40s,72℃延伸1min,共30个循环;最后72℃ 延伸5min,4℃保温。 9.3 电泳 用TAE电泳缓冲液(见B.10)配制1%~2%的琼脂糖凝胶(含1μg/mLEB,见B.11)。将凝胶放 入水平电泳槽,使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6μL样品和溴酚蓝指示剂溶液按比例混匀后加入样品 孔。在电泳时使用核酸分子质量标准参照物作对照。5V/cm电泳约0.5h,当溴酚蓝到达底部时停止。 在凝胶成像仪或紫外投射灯下观察有无DNA带并判定结果。 也可使用全自动毛细管电泳仪进行电泳。 9.4 测序和分析 对扩增产物进行序列测定,测序结果与GenBank中的序列进行比对(按附录C)。 9.5 结果判定 将标准菌株的核酸设立为阳性对照,空白对照、阴性对照均成立,视为反应结果符合。PCR无扩增 或扩增片段大小不符合,判定为鲁氏耶尔森氏菌阴性。若扩增处出现587bp阳性扩增带,且扩增产物 的序列与GenBank中鲁氏耶尔森氏菌的序列相似度≥98.0%,则需要按照第10章中所述,进行细菌分 离和细菌初步鉴定,将符合11.3判定的疑似鲁氏耶尔森氏菌进行进一步的细菌PCR鉴定或生化鉴定 确定。 10 细菌分离和培养 用接种环将无菌操作采集的组织在TSA或BHIA上划线,于20℃~25℃培养48h~72h。菌落 形态为圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐、有光泽的乳白色半透明菌落,直径2mm~3mm。 3SN/T5665—202311 细菌初步鉴定 11.1 革兰氏染色 将可疑菌落涂片,进行革兰氏染色,镜检观察。如观察到红色短杆状细菌,表明为革兰氏阴性菌。 11.2 氧化酶试验 在一载玻片上放一块滤纸片,然后用一滴蒸馏水湿润纸片,再用接种环取单个菌落于上述湿的纸片 上,最后在其上加一滴氧化酶试剂。若在1min~2min不变色,表明该菌氧化酶阴性。 11.3 结果判定 革兰氏染色阴性,氧化酶试验阴性,菌体呈微弯曲的短杆状细菌,可判定为疑似鲁氏耶尔森氏菌,需 做细菌PCR鉴定或生化鉴定确定。 12 细菌分离物生化鉴定 对上述疑似鲁氏耶尔森氏菌进一步做生化鉴定,鉴定结果见表1。也可采用商品化的生化鉴定试 剂盒按其说明书要求进行操作,或采用全自动微生物鉴定系统进行鉴定。 表1 鲁氏耶尔森氏菌生化特性表 生化反应 结果 生化反应 结果 β-半乳糖苷 + 肌醇 - 精氨酸 - 山梨醇 - 赖氨酸脱羧酶 + 鼠李糖 - 鸟氨酸脱羧酶 + 蔗糖 - 柠檬酸 - 蜜二糖 - H2S - 苦杏仁苷 - 尿素 - 阿拉伯糖 - 色氨酸脱氨酶 - 氧化酶 - 吲哚产生 - 硝酸盐还原 - V-P反应 + 25℃运动性 + 明胶 - 麦康凯培养基生长 + 葡萄糖 + 氧化-发酵试验(O/F) + 甘露醇 + — 注:“+”为结果阳性,“-”为结果阴性。 13 综合判定 13.1 组织样品经PCR检测为阳性,且经过细菌分离培养,进一步生化鉴定或者细菌PCR鉴定,结果 4SN/T5665—2023