ICS11.220 CCSB41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5663—2024 袋鼠疱疹病毒感染检疫技术规范 Quarantineprotocolformacropodidherpesvirusinfection 2024-12-31发布 2025-07-01实施 中华人民共和国海关总署发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国天津海关、中华人民共和国青岛海关。 本文件主要起草人:帅江冰、张晓峰、何永强、莫虹斐、曾若雪、金晨晨、陈小金、郑小龙、赵丹、张俊哲、 董志珍。 ⅠSN/T5663—2024袋鼠疱疹病毒感染检疫技术规范 1 范围 本文件规定了袋鼠疱疹病毒感染的聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光PCR检测方法的技术要求。 本文件适用于袋鼠疱疹病毒感染(见附录A)的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088 出入境动物检疫采样 GB19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件: BHQ1:黑洞淬灭基团1(Blackholequencher1); Ct:循环阈值(Cyclethreshold); DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid); dNTPs:三磷酸脱氧核苷酸(Deoxynucleosidetriphosphate); FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein); MaHV:袋鼠疱疹病毒(Macropodidherpesvirus); PCR:聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction)。 5 实验室生物安全要求 样品处理及检测过程中所涉及的试验操作,应符合GB19489的有关规定。 6 试剂和材料 6.1 水:符合GB/T6682中一级水的要求。 6.2 灭菌生理盐水:配制方法见附录B中B.1。 6.3 Trizol裂解液。 1SN/T5663—20246.4 蛋白酶K溶液(20mg/mL)。 6.5 Tris饱和酚。 6.6 三氯甲烷。 6.7 异丙醇。 6.8 无水乙醇。 6.9 E×Taq酶。 6.10 10×PCR缓冲液。 6.11 dNTPs(含dCTP、dGTP、dATP、dTTP)。 6.12 琼脂糖。 6.13 DNA分子质量标准。 6.14 TAE电泳缓冲液:配制方法见B.2。 6.15 上样缓冲液:配制方法见B.3。 6.16 质控物质:阳性质控品为含MaHV目的基因的质粒(序列参考信息见附录C);阴性质控品为不 含MaHV的组织或血清。 6.17 PCR引物序列: 上游引物UL27-F2.3:5'-TGTTTCGCATGTTTGGTATG-3'; 下游引物UL27-R2.3:5'-AAMCCCACAGTGTTCCACCC-3'。 引物用ddH2O溶解至10μmol/L后,保存于-20℃备用。 6.18 荧光PCR引物和探针序列: 上游引物UL27-F1:5'-GGGAYTGGGTTCCCAAGAA-3'; 下游引物UL27-R1:5'-TGGTMGTGAAGGTGGTRGATA-3'; 探针序列UL27-probe:FAM-TGGCAAGAAGTCGATGAGATGCTCCG-BHQ1。 引物和探针分别用ddH2O溶解至10μmol/L后,保存于-20℃备用。 7 仪器和设备 7.1 Ⅱ级生物安全柜 7.2 PCR仪。 7.3 荧光定量PCR仪。 7.4 分析天平(感量0.001g)。 7.5 漩涡振荡器。 7.6 台式冷冻离心机。 7.7 微量可调移液器:0.1μL~2.5μL、2μL~20μL、20μL~200μL、100μL~1000μL。 7.8 电泳仪。 7.9 凝胶成像系统。 8 样品采集与制备 8.1 根据GB/T18088确定采样动物数量。 8.2 鼻拭子:将棉拭子深入鼻腔深处,轻轻旋转拭子3圈~5圈,然后慢慢取出,将拭子放入盛有灭菌生 理盐水的采样管中。 8.3 血液样品:采用含有抗凝剂的真空采血管无菌采集袋鼠血液样品,4℃保存备用。 8.4 粪便或泄殖腔拭子:采集新鲜粪便样品,加入等体积灭菌生理盐水,振荡;将拭子深入泄殖腔转一 2SN/T5663—2024圈并蘸取少量粪便,放入盛有2mL灭菌生理盐水的采样管中。3000r/min4℃离心10min,取上清 备用。 8.5 组织样品:无菌采集临床发病袋鼠的主要靶器官,称重1g加入适量灭菌生理盐水研磨匀浆,制成 20%悬液(质量浓度),冻融2次~3次,4000r/min4℃离心10min,取上清备用。 9 聚合酶链式反应(PCR) 9.1 核酸提取 9.1.1 取200μL全血或上清样品至1.5mL离心管,加入600μLTrizol溶液,振荡混匀后,室温放置 5min。 9.1.2 加200μL三氯甲烷,盖紧盖子,摇动15s,室温放置3min后,4℃12000r/min离心15min。 9.1.3 吸取上清至新的离心管,加入500μL预冷的异丙醇,上下翻转混匀,室温放置10min。 9.1.4 4℃12000r/min离心15min,缓慢弃上清,将离心管倒置于吸水纸上,将液体去除。 9.1.5 加入1000μL预冷的75%乙醇缓慢倒转洗涤沉淀。 9.1.6 4℃12000r/min离心15min,弃上清,将离心管倒置于吸水纸上,室温干燥沉淀5min~ 10min。 9.1.7 加入40μL去离子水,4000r/min离心5s,室温溶解10min。立即使用或-70℃保存备用。 9.1.8 应设立阳性和阴性对照样品,同步进行核酸提取。以MaHV阳性样品或含有MaHV目的基因 的质粒作为阳性对照样品;以不含MaHV的血清或组织样品为阴性对照样品。 9.1.9 可采用等效的商品化DNA提取试剂盒代替以上方法。 9.2 PCR扩增 9.2.1 反应体系 将PCR试剂、引物等室温融化,2000r/min离心5s。按样品和对照数量配置反应液,每个反应管 包含的成分见表1。 表1 PCR反应体系配置 成分 加样量 终浓度 10×Taqbuffer 2.5μL 1× 10mmol/LdNTPs 0.5μL 0.2mmol/L 10μmol/L上游引物 1μL 0.4mmol/L 10μmol/L下游引物 1μL 0.4mmol/L 5U/μLE×Taq酶 0.25μL 0.5U/μL 蒸馏水 16.75μL — 充分混匀,向每个反应管中各分装22μL,最后加入核酸提取液3μL。 试验应设立阳性、阴性和空白对照。以MaHV阳性样品或含有MaHV目的基因的质粒提取的核 酸作为阳性对照;以不含MaHV的血清或组织样品提取的核酸为阴性对照;用去离子水作为空白对照。 PCR扩增可采用等效的商品化试剂盒,并按其说明书使用。 9.2.2 反应条件 将PCR反应管瞬时离心后,置于PCR仪,按以下程序进行扩增:95℃预变性10min;95℃变性 3SN/T5663—202410s,60℃退火30s,72℃延伸7min,共35个循环。扩增产物于4℃保存。 9.2.3 琼脂糖凝胶电泳 在产物分析区进行扩增产物电泳。制备含1.0μg/mL核酸染料的1%琼脂糖凝胶板,在电泳槽中 加入1×TAE电泳缓冲液,使液面刚刚没过凝胶。取5μLPCR产物,与1.0μL5×加样缓冲液混 合,加入琼脂糖凝胶板的加样孔中,同时加入DNA分子质量标准。盖好电泳仪,插上电极,以10V/cm 恒压电泳,至溴酚蓝指示剂迁移经过凝胶约2/3长度时结束电泳。将凝胶置于凝胶成像仪下观察电泳 结果,并做好记录。 9.3 结果判定 经琼脂糖凝胶电泳后,阳性对照出现大小为249bp的特异性条带,阴性对照和空白对照无条带,则 试验成立。 待检样品电泳后出现249bp的特异性条带,则初步判定为袋鼠疱疹病毒核酸阳性,PCR产物进行 测序,将测序结果与标准参考序列(见附录C)进行比对,序列一致性达98%以上的,判定为袋鼠疱疹核 酸阳性,并可确定其基因型。 待检样品电泳无条带或条带大小不是249bp的,判定为袋鼠疱疹病毒核酸阴性。 10 实时荧光聚合酶链式反应(荧光PCR) 10.1 核酸提取 同9.1。 10.2 荧光PCR扩增 10.2.1 反应体系 将荧光PCR试剂、引物探针等室温融化,2000r/min离心5s。按样品和对照数量配置反应液,每 个反应管包含的成分见表2。 表2 荧光PCR反应体系配置 成分 加样量 终浓度 10×Taqbuffer 2.5μL 1× 10mmol/LdNTPs 0.5μL 0.2mmol/L 10μmol/L上游引物 1.2μL 0.48mmol/L 10μmol/L下游引物 1.2μL 0.48mmol/L 10μmol/L探针 1.2μL 0.48mmol/L 5U/μLE×Taq酶 0.25μL 0.5U/μL 蒸馏水 10.15μL — 充分混匀,向每个反应管中各分装17μL,最后加入核酸提取液3μL。 试验时应设立阳性、阴性和空白对照