̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS67.050 CCS X04 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5656—2023 食品中5种杂粮成分定性检测方法 实时荧光PCR法 Qualitative detection method of five kinds of coarse cereals in food— Real-time fluorescence PCR method 2023-11-01发布 2024-05-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 食品中5种杂粮成分定性检测方法 实时荧光PCR法 SN/T 5656—2023 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023) 编辑部:(010)65194242-7530 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张0.75 字数21千字 2024年4月第一版 2024年4月第一次印刷 印数 1—500 * 书号: 155175·1035 定价16.00元̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国大连海关、中华人民共和国成都海关、大连民族大学、中华人民共 和国拱北海关、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国天津海关。 本文件主要起草人:杨爱馥、万超、白景莲、梁冰、胡江涛、郑秋月、田卓、孙骥扬、徐君怡、姚丽锋、 蔡一村、邱向锋、刘雪华、姜丽、徐杨、林华、马兴、李雪梅、高世光、王琦。 ⅠSN/T5656—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 食品中5种杂粮成分定性检测方法 实时荧光PCR法 1 范围 本文件规定了食品中菰米(包括中国菰Zinania latifolia 、水生菰 Z. aquatica、沼生菰 Z. palus- tris和德克萨斯菰 Z. texana)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、奇亚籽(Salvia hispanica)、藜麦(Chenopo- dium quinoa,包括白藜麦、黑藜麦、红藜麦)和薏苡仁(Coix lacryma-jobi)源性成分的实时荧光PCR检 测方法。 本文件适用于食品中菰米、鹰嘴豆、奇亚籽、藜麦和薏苡仁源性成分的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403—2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适应于本文件。 3.1 菰米 wild rice 禾本科菰属植物的颖果。 注1: 属于全谷物,具有极高的营养价值。 注2: 菰属植物有4种,包括中国菰、水生菰、沼生菰和德克萨斯菰。 注3: 本文件中菰米源性成分即指中国菰、水生菰、沼生菰、德克萨斯菰的特异性DNA片段。 3.2 鹰嘴豆 chickpea 豆科鹰嘴豆属植物。 注1: 起源于亚洲西部和近东地区。 注2: 本文件中鹰嘴豆源性成分即指栽培种鹰嘴豆的特异性DNA片段。 3.3 奇亚籽 chia seed 唇形科鼠尾草属芡欧鼠尾草的种子。 注1: 原产地为墨西哥南部和危地马拉等北美洲地区,具有极高的营养价值。 注2: 本文件中奇亚籽源性成分即指芡欧鼠尾草种子的特异性DNA片段。 1SN/T5656—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 3.4 藜麦 quinoa 藜科藜属植物。 注1: 藜麦种子颜色主要有白、黑、红等颜色。 注2: 本文件中藜麦源性成分即指白藜麦、黑藜麦、红藜麦的特异性DNA片段。 3.5 薏苡仁 coix seed 薏苡的干燥成熟种仁。 注1: 又名薏米、苡米、苡仁等,是禾本科薏苡属植物。 注2: 本文件中薏苡仁源性成分即指栽培种薏苡的特异性DNA片段。 3.6 实时荧光PCR real-time fluorescence PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。 3.7 Ct值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适应于本文件。 CIA-2:叶绿体介导体2基因(chloroplast import apparatus-2 gene) CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammonium bromide) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid) dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate) ITS: 核糖体内转录间隔区(internal transcribed space) OD:光密度值(optical density) PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) SAD:硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶(stearoyl-acyl-carrier protein desaturase) Taq DNA 聚合酶:耐热DNA聚合酶(Taq DNA polymerase) Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane] trnL-trnF:trnL基因和trnL-trnF基因间隔区序列(tRNA-Leu gene and trnL-trnF intergenic spacer) 18SrRNA:真核生物核糖体小亚基18S基因(18S ribosomal RNA) 5 方法提要 样品经研磨后,提取DNA,分别采用菰米、鹰嘴豆、奇亚籽、藜麦和薏苡仁基因序列的特异性引物和 探针对样品DNA进行TaqMan实时荧光PCR扩增,根据Ct值,判断该样品中是否存在菰米、鹰嘴豆、 奇亚籽、藜麦或薏苡仁成分。 6 试剂和材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。所有试 2SN/T5656—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 剂均用无DNA酶污染的容器分装。 6.1 实时荧光PCR扩增引物和探针序列见表1。菰米、鹰嘴豆、奇亚籽、藜麦和薏苡仁引物扩增的靶 标序列见附录A。 表1 实时荧光PCR扩增引物和探针序列信息表 名称 引物/探针序列(5’-3’) 目的基因 内参照5’端引物 内参照3’端引物 内参照探针TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC-TAMRA真核生物 18SrRNA基因 菰米5’端引物 菰米3’端引物 菰米探针CGAGAGTCGTGTGGATGTTGT TGCGGAAGGATCATTGTCGT FAM-CGGCGGTCGGTAAGAGGTGTTCC-TAMRA ITS基因 鹰嘴豆5’端引物 鹰嘴豆3’端引物 鹰嘴豆探针AGAAGAAGGTTGTTACGGTGGAG CGGTGCGTCGGAGATAGGA FAM-GAAGGCGTTCGGAATGCTTGGTCTGATAAA-TAMRACIA-2基因 奇亚籽5’端引物 奇亚籽3’端引物 奇亚籽探针ATTAATAATGACTAATGTTGACCCC GATGAATATTCGATTTATTCTTCAACA FAM-CTGTTTTTTAATATGAA AA+TGGA AAA ATCGA+TG+TG-TAMRAtrnL-trnF基因 藜麦5’端引物 藜麦3’端引物 藜麦探针CACAAGTCTTGTGATATATATATGATTAG ACAAAGTCTTATATGCGTACCAGAATT VIC-TAATATGAATTGTGAATCACTAAACTGAGTACCC-TAMRAtrnL-trnF基因 薏苡仁5’端引物 薏苡仁3’端引物 薏苡仁探针GTCTGGGAGCATTTTGCTTGC TCCATGTCCACGCCCAGTTC VIC-TCTCATAGAGTGATAGGAGAATGTCCGTCTGTGTTC-TAMRA SAD基因 注: + 代表锁核酸(LNA) 6.2 CTAB 缓冲液:55 mmol/L CTAB,1 400 mmol/L NaCl,20 mmol/L EDTA,100 mmol/L Tris, 调pH至8.0,121 ℃高压灭菌20 min,备用。 6.3 TE缓冲液(Tris-Cl、EDTA缓冲液):10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),1 mmol/L EDTA(pH8.0)。 6.4 蛋白酶K:20 mg/μL。 6.5 Tris饱和酚。 6.6 三氯甲烷。 6.7 异戊醇。 6.8 异丙醇。 6.9 70%乙醇。 6.10 实时荧光PCR反应混合液:12.5 μ