̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS67.050 CCS C53 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5654—2024 明胶中猪源性成分鉴定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of porcine derived components in gelatin— LC-MS/MS method 2024-12-31发布 2025-07-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国上海海关、中华人民共和国青岛海关、上海体育学院。 本文件主要起草人:古淑青、陈念念、赵超敏、霍忆慧、封卓然、张晓梅、邓晓军、伊雄海、郭德 华、张鸿伟。 ⅠSN/T5654—2024̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 明胶中猪源性成分鉴定 液相色谱-质谱/质谱法 1 范围 本文件描述了明胶中猪源性成分的液相色谱-质谱/质谱法检测方法。 本文件适用于明胶中猪源性成分的确证和测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 方法提要 试样中的明胶经提取,二硫苏糖醇(DDT)还原,碘代乙酰胺(IAA)烷基化,胰蛋白酶酶解,液相色 谱-质谱/质谱检测猪源性特征肽段。建立特征肽段的响应强度与明胶含量的线性关系,外标法定量。 5 试剂和材料 除另有规定外,所用试剂均为分析纯,水为符合GB/T 6682规定的一级水。 5.1 试剂 5.1.1 丙酮(C3H6O):色谱纯。 5.1.2 甲酸(HCOOH):色谱纯。 5.1.3 乙腈(CH3CN):色谱纯。 5.1.4 盐酸(HCl)。 5.1.5 三氯乙酸(C2HCl3O2)。 5.1.6 三羟甲基氨基甲烷(C4H11NO3,Tris)。 5.1.7 二硫苏糖醇(C4H10O2S2,DTT)。 5.1.8 碘代乙酰胺(ICH2CONH2,IAA)。 5.1.9 二水合氯化钙(CaCl2·2H2O)。 5.1.10 氯化钠(NaCl)。 5.1.11 胰蛋白酶:活力大于10 000 BAEE每毫克蛋白质。 1SN/T5654—2024̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 5.2 试剂配制 5.2.1 盐酸溶液(10%,体积分数):准确移取 1.0 mL 盐酸(5.1.4),用水定容至 10 mL。 5.2.2 Tris-HCl溶液(50 mmol/L):称取6.057 g三羟甲基氨基甲烷(5.1.6),溶解于800 mL水中, 用10%盐酸(5.2.1)调节pH值至8.0±0.10,用水定容至1 000 mL。 5.2.3 二硫苏糖醇(50 mmol/L):称取 0.077 g 二硫苏糖醇(5.1.7),用水溶解后定容至10 mL。4 ℃ 冷藏可保存1个月。 5.2.4 碘代乙酰胺溶液(50 mmol/L):称取 0.092 g 碘代乙酰胺(5.1.8),用水溶解后定容至10 mL; 4 ℃避光冷藏保存1个月。 5.2.5 消化缓冲液(20 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl,50 mmol/L NaCl,50 mmol/L CaCl2):称取0.367 g CaCl2·2H2O(5.1.9)、0.146 g NaCl(5.1.10),加入 20 mL Tris-HCl溶液(5.2.2),用水溶解后定容至 50 mL。 5.2.6 甲酸水溶液(0.1%,体积分数):准确移取 1.0 mL 甲酸(5.1.2),用水定容至 1 000 mL。 5.2.7 甲酸乙腈溶液(0.1%,体积分数):准确移取 1.0 mL 甲酸(5.1.2),用乙腈(5.1.3)定容 至1 000 mL。 5.2.8 三氯乙酸水溶液(30%,质量浓度):准确称取15 g三氯乙酸(5.1.5),用水稀释至50 mL。 5.2.9 胰蛋白酶溶液(100 μg/mL):称取1 mg胰蛋白酶(5.1.11),用Tris-HCl溶液(5.2.2)溶解后定 容至 10 mL。溶液分装后于-20 ℃可保存6个月。 5.3 标准品 猪明胶(来源于猪皮肤,CAS 号: 9000-70-8),纯度≥95%。 5.4 标准溶液配制 5.4.1 标准储备溶液:准确称取50 mg猪明胶(5.3),加入适量Tris-HCl溶液(5.2.2),涡旋混匀,置于 水浴锅50 ℃加热至完全溶解。再用Tris-HCl溶液(5.2.2)定容至 50 mL,配制成浓度为1 mg/mL的 明胶标准储备溶液。分装于低蛋白吸附离心管,-20 ℃以下避光保存,有效期1个月。取出后放至室 温,涡旋混匀后使用。 5.4.2 标准工作溶液:准确移取猪明胶标准储备溶液(5.4.1)于低蛋白吸附离心管,用纯水稀释,配制 成浓度0.002 mg/mL、0.02 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL的系列标准 工作溶液,-20 ℃冷冻保存,有效期1周。 5.5 材料 5.5.1 微孔滤膜:水相低蛋白吸附滤膜,0.22 μm。 5.5.2 离心管:50 mL带盖塑料离心管,1.5 mL低蛋白吸附离心管。 5.5.3 10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL低蛋白吸附枪头。 6 仪器和设备 6.1 液相色谱-质谱/质谱仪:配有电喷雾离子(ESI)源。 6.2 分析天平:感量为0.001 g、0.000 1 g、0.000 01 g。 6.3 恒温水浴锅。 6.4 离心机:转速不低于10 000 r/min。 6.5 涡旋振荡器。 2SN/T5654—2024̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 6.6 pH计:测量精度为0.01。 6.7 微量移液器:0.5 μL~10 μL,10 μL~100 μL,20 μL~200 μL,100 μL~1 000 μL。 7 试样制备与保存 7.1 试样制备 取出代表性样品,固体样品冷冻后经粉碎机粉碎,用四分法缩分出不少于5.0 g试样,粉状样品均 分成两份,每份不少于5.0 g,装入清洁容器内,加封后作出标记,一份作试样,一份作留样。 7.2 试样保存 按照样品产品标签规定的贮藏条件保存,未标明贮藏条件的,常温避光保存。 8 分析步骤 8.1 试样前处理 准确称取0.1 g(精确到0.01 g)试样于50 mL具塞塑料离心管中。加入适量Tris-HCl(5.2.2)溶 液,涡旋混匀,置于水浴锅50 ℃加热提取1 h,冷却至室温后定容至25 mL。10 000 r/min离心5 min, 取上清液500 μL于1.5 mL低蛋白吸附离心管,缓缓加入500 μL三氯乙酸溶液(5.2.8)。充分振荡混 匀,4 ℃静置30 min。10 000 r/min离心10 min,弃上清。加入500 μL冰浴丙酮(-20 ℃)洗涤沉淀, 10 000 r/min离心5 min后弃丙酮清液,于通风橱放置2 h至丙酮完全去除。加入500 μL超纯水水浴 40 ℃加热至重新溶解。 8.2 酶解 分别准确移取50 μL明胶提取液(8.1)和系列标准工作溶液(5.4.2)于1.5 mL低蛋白吸附离心 管,加入50 μL消化缓冲溶液(5.2.5)、4 μL二硫苏糖醇溶液(5.2.3),混匀后置75 ℃下恒温水浴 30 min;冷却至室温,加入9 μL碘代乙酰胺溶液(5.2.4),暗处静置30 min;再加入5 μL胰蛋白酶溶液 (5.2.9),充分混匀后置于37 ℃恒温水浴中酶解5 h。加入5 μL甲酸(5.1.2),混匀后在室温下静置 15 min以终止酶解反应。加水定容至1 mL,涡旋混匀,用0.22 μm滤膜(5.5.1)过滤,供液相色谱-质 谱/质谱仪检测。 8.3 仪器参考条件 8.3.1 液相色谱条件 液相色谱条件如下: a) 色谱柱:C18柱,100 mm×2.1 mm(内径),填料粒径 1.7 μm,孔径 30 nm(300 Å)或性能相 当者。 b) 柱温:40 ℃。 c) 流动相:A:0.1%(质量分数)甲酸-乙腈,B:0.1%(质量分数)甲酸-水,梯度洗脱见表1。 d) 流速:0.3 mL/min。 e) 进样量:5 μL. 3SN/T5654—2024̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 表1 梯度洗脱程序 时间 minA %B % 0.0 5.0 95.0 2.0 5.0 95.0 7.0 60.0 40.0 8.0 60.0 40.0 8.1 5.0 95.0 10.0 5.0 95.0 8.3.2 质谱条件 质谱条件如下: a) 电离方式:电喷雾电离,正离子。 b) 扫描方式:多反应监测(MRM)。 c) 电喷雾电压:3 000 V。 d) 离子源温度:3