̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS67.050 CCSX04 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5650—2024 蜂蜜中红花成分定性检测方法 实时荧光PCR法 Qualitative identification of safflower ingredient in honey— Real-time PCR method 2024-12-31发布 2025-07-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国广州海关、中华人民共和国伊宁海关、中国农业科学院蜜蜂研究 所、中国农业大学、新疆瑞峰源蜂业有限公司。 本文件主要起草人:刘津、叶尔保勒、孟茹、王凯、高东微、董洁、梁颖婕、陈文锐、涂璐、金晓露、 李思德、韩方志、李发强。 ⅠSN/T5650—2024̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 蜂蜜中红花成分定性检测方法 实时荧光PCR法 1 范围 本文件规定了蜂蜜中红花成分的实时荧光PCR检测方法。 本文件适用于蜂蜜中红花成分定性检测。本方法所规定方法的最低检出限(LOD)为1%(质量百 分比)。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 蜂蜜 honey 蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露,与自身分泌物混合后,经充分酿造而成的天然甜物质。 3.2 红花 safflower 红花(Carthamus tinctorius L.)别名红蓝花、刺红花,是菊科红花属药用植物。 3.3 Ct值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AS:花色素合成酶基因(anthocyanidin synthase gene) CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid) PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) Tris: 三羟甲基氨基甲烷(tris (hydroxymethyl) aminomethane) tRNALeu:叶绿体亮氨酸转运核糖核酸基因(leucine transport RNA gene from chloroplast) 1SN/T5650—2024̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 5 方法提要 提取蜂蜜样品DNA,以红花的DNA为阳性对照,以其他蜜源植物DNA为阴性对照,无菌水作为 空白对照,使用红花特异性引物和探针进行实时荧光PCR扩增,观察实时荧光PCR的扩增信号,判断 样品中是否含有红花成分。 6 试剂和材料 6.1 实验用水:应符合GB/T 6682中一级水的规格。 6.2 三氯甲烷(氯仿)。 6.3 异丙醇。 6.4 体积分数为70%的乙醇。 6.5 NaCl溶液:1.2 mol/L。 6.6 蛋白酶K:20 mg/mL。 6.7 CTAB提取缓冲液:20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02 mol/L Na2EDTA,pH8.0。 6.8 CTAB沉淀液:5 g/L CTAB,40 mmol/L NaCl。 6.9 实时荧光PCR预混液:Taq DNA 聚合酶、PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs(含dATP、dUTP、 dCTP、dGTP))和UNG酶按比例配制的溶液。 6.10 引物和探针:红花成分扩增引物和探针、内参照(高等植物叶绿体基因)引物和探针见表1。红花 引物扩增的目标序列见附录A。 表1 引物探针序列信息 类别 引物/探针序列(5’→3’) 目标基因 高等植物叶绿体tRNA-F: CGRAATYGGTAGACGCTACG tRNA-R: TTCCATYGAGTCTCTGCACCT tRNA-P: FAM-TGGGGCAATCCTGAGCCAAATCC-TAMRAtRNALeu 红花AS-F: TCGTTGTCTCAAGTACCAATAATCA AS-R: CCAATCTTTACAAGCAAGGTGTAG AS-P: FAM-ATTTATCGTCAAAAAGCTCCGAGCTAGAGA-BHQ1AS 7 仪器设备 7.1 离心机:离心力≥12 000 g。 7.2 恒温混匀仪:65 ℃±1 ℃,转速≥650 r/min。 7.3 恒温水浴锅:50 ℃±1 ℃。 7.4 实时荧光PCR仪。 7.5 核酸蛋白分析仪。 7.6 涡旋振荡器。 7.7 单道移液器:2 μL~20 μL,10 μL~100 μL,50 μL~200 μL,100 μL~1 000 μL,500 μL 2SN/T5650—2024̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ~5 000 μL。 8 DNA提取 8.1 样品前处理 8.1.1 蜂蜜样品50 ℃水浴20 min至充分融化,上下颠倒混匀。 8.1.2 蜂蜜样品DNA提取设置2个平行。分别取2个50 mL 离心管,每管加入10 mL蜂蜜样品和 20 mL无菌水,涡旋混匀,4 000 g离心10 min,弃上清。 8.1.3 沉淀用1 mL无菌水充分溶解并转移至2 mL离心管中,13 000 g离心5 min,弃上清,沉淀用于 DNA提取。 8.2 CTAB法 8.2.1 加入600 μL CTAB提取缓冲液,置于恒温混匀仪中,65 ℃,650 r/min,温育1 h~2 h;13 000 g 离心10 min。 8.2.2 转移上清液至2 mL离心管中;加入0.7倍体积的三氯甲烷,剧烈振荡混匀,室温13 000 g离心 10 min。 8.2.3 加入等体积CTAB沉淀液混匀,13 000 g离心10 min。 8.2.4 弃上清,加入350 μL 1.2 mol/L NaCl溶液,充分溶解沉淀。 8.2.5 加入0.8倍体积的异丙醇混匀,-20 ℃放置0.5 h~1 h,4 ℃,13 000 g离心15 min。 8.2.6 弃上清,用70%乙醇洗涤沉淀一次,4 ℃,13 000 g离心10 min。 8.2.7 弃上清,室温下晾干。加入50 μL~100 μL 双蒸水,溶解沉淀,该溶液为DNA溶液,可在4 ℃ 保存7 d。 8.3 试剂盒法 采用商品化的植物基因组DNA提取纯化试剂盒,按照试剂盒使用说明书提取DNA。 8.4 DNA浓度和纯度的测定 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260 nm和280 nm处的吸光值A260和A280。 DNA的浓度按照公式(1)计算: c=A×N×50/1 000 …………………………( 1 ) 式中: c———DNA 浓度,单位为微克每微升(μg/μL); A———260 nm 处的吸光值; N———核酸稀释倍数。 当A260/A280比值在1.7~2.0之间时,适宜于 PCR 扩增。 9 实时荧光PCR扩增 9.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置 9.1.1 阴性对照:内参照基因的阴性对照为非高等植物的基因组DNA,红花基因的阴性对照为其他蜜 源植物的基因组DNA。 9.1.2 阳性对照:含有目标基因的植物基因组DNA或人工合成的质粒DNA。 3SN/T5650—2024̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 9.1.3 空白对照:包括DNA提取时的提取空白对照(以水代替样品),以及PCR反应时的试剂空白对 照(以水代替DNA模板)。 9.2 反应体系 反应体系配制见表2。每个样品的2个DNA提取平行样,分别进行荧光PCR检测。 表2 荧光PCR反应体系 红花/AS 高等植物叶绿体/tRNALeu 试剂 终浓度 试剂 终浓度 实时荧光PCR预混液 1× 实时荧光PCR预混液 1× AS-F 0.5 μmol/L tRNA-F 0.2 μmol/L AS-R 0.5 μmol/L tRNA-R 0.2 μmol/L AS-P 0.5 μmol/L tRNA-P 0.1 μmol/L DNA模板 50 ng ~500 ng DNA模板 50 ng ~500 ng ddH2O 补至25 μL ddH2O 补至25 μL 注: 建议选用商品化实时荧光PCR预混液。 9.3 反应参数 反应参数为:50 ℃ 2 min;预变性95 ℃