̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS67.050 CCS X04 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5642.1—2023 出口乳制品中乳酸菌检测方法 数字PCR计数法 第1部分:青春双歧杆菌 Detection of lactic acid bacteria in dairy products for export— Enumeration method of digital PCR— Part 1: Bifidobacterium adolescentis 2023-11-01发布 2024-05-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 出口乳制品中乳酸菌检测方法 数字PCR计数法 第1部分:青春双歧杆菌 SN/T 5642.1—2023 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023) 编辑部:(010)65194242-7530 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张0.75 字数17千字 2024年4月第一版 2024年4月第一次印刷 印数 1—500 * 书号: 155175·1009 定价16.00元̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件为SN/T 5642《出口乳制品中乳酸菌检测方法 数字PCR计数法》的第1部分。 SN/T 5624已经发布了以下部分: ———第1部分:青春双歧杆菌; ———第2部分:两双歧杆菌; ———第3部分:动物双歧杆菌; ———第4部分:植物乳杆菌; ———第5部分:鼠李糖乳杆菌; ———第6部分:嗜酸乳杆菌; ———第7部分:副干酪乳杆菌。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中国海关科学技术研究中心、中华人民共和国上海海关、上海市质量监督检验技 术研究院。 本文件主要起草人:魏海燕、马丹、魏咏新、李丹、杨娟、赵晓娟、张奕南、张西萌、杨捷琳、汪琦、曾静、 刘洋。 ⅠSN/T5642.1—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 引 言 乳酸菌是一群通过发酵糖类产生大量乳酸的细菌总称,目前市场上添加乳酸菌的乳制品种类繁多, 良莠不齐,由此,对该类产品质量的监管,特别是对其所含乳酸菌种类和数量的鉴定就显得尤为重要。 SN/T 5642《出口乳制品中乳酸菌检测方法 数字PCR 计数法》作为出口乳制品检验技术的推荐性行 业标准,为出口乳制品中的乳酸菌提供快速定量检验方法。 SN/T 5642拟由7个部分构成。 ———第1部分:青春双歧杆菌。目的在于提供出口乳制品中青春双歧杆菌的微滴式数字PCR计数 方法。 ———第2部分:两双歧杆菌。目的在于提供出口乳制品中两双歧杆菌的微滴式数字PCR计数 方法。 ———第3部分:动物双歧杆菌。目的在于提供出口乳制品中动物双歧杆菌的微滴式数字PCR计数 方法。 ———第4部分:植物乳杆菌。目的在于提供出口乳制品中植物乳杆菌的微滴式数字PCR计数 方法。 ———第5部分:鼠李糖乳杆菌。目的在于提供出口乳制品中鼠李糖乳杆菌的微滴式数字PCR计数 方法。 ———第6部分:嗜酸乳杆菌。目的在于提供出口乳制品中嗜酸乳杆菌的微滴式数字PCR计数 方法。 ———第7部分:副干酪乳杆菌。目的在于提供出口乳制品中副干酪乳杆菌的微滴式数字PCR计数 方法。 ⅢSN/T5642.1—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 出口乳制品中乳酸菌检测方法 数字PCR计数法 第1部分:青春双歧杆菌 1 范围 本文件规定了出口乳制品中青春双歧杆菌的微滴式数字PCR计数方法。 本文件适用于乳制品中青春双歧杆菌的微滴式数字PCR快速定量检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB 4789.35 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403—2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 定量限 limit of quantification;LOQ 在相对标准偏差不超过25%的条件下,方法所能定量检测的目标菌最低含量。 3.2 微反应体系 tiny reaction system 将含有模板、引物/探针、Taq酶及其缓冲液充分混匀后分配至体积相同且相互物理隔离的油包水 液滴中所形成的小体积荧光PCR反应体系。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid) ddPCR:微滴式数字PCR(droplet digital polymerase chain reaction) hsp 60:热休克蛋白60编码基因(heat shock protein 60 gene) PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) PMA:叠氮溴化丙锭(propidium monoazide ) 5 方法原理 PMA是一种具有DNA高亲和力的光反应染料,在强可见光下可与待测样本中死菌或游离双链 1SN/T5642.1—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э DNA形成共价连接,从而阻止死菌或游离DNA的后续PCR扩增,确保ddPCR检测到的结果来源于 样本中的活菌细胞。针对青春双歧杆菌单拷贝基因hsp 60保守序列设计引物/探针。将含有引物/探 针、样品DNA及反应预混液的ddPCR反应体系分布到大量微反应体系中,然后进行PCR扩增。 hsp 60基因探针5’端标记FAM荧光基团,通过对每个微反应体系的荧光信号进行采集分析,判断每 个微反应体系的扩增结果,根据微反应体系阳性率和泊松分布公式计算出ddPCR反应体系中hsp 60 基因拷贝数,并根据样品稀释倍数、提取DNA溶解体积以及数字PCR反应体系中加入的模板DNA量 等参数来计算样品中青春双歧杆菌的含量。 6 主要设备及耗材 6.1 天平:感量0.1 g。 6.2 均质器。 6.3 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。 6.4 高速台式离心机:离心力12 000 g。 6.5 涡旋振荡仪。 6.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.7 卤钨灯:500 W 6.8 ddPCR系统:微滴发生器或其他具有同样功能的仪器、微滴荧光检测仪或其他具有同样功能的 仪器。 6.9 PCR扩增仪。 6.10 不同量程移液器:100 μL~1 000 μL、20 μL~200 μL、10 μL~100 μL、0.5 μL~10 μL。 6.11 离心管:2 mL、1.5 mL和0.2 mL。 6.12 ddPCR微滴生产连排管及覆膜。 7 材料与试剂 7.1 仅使用分析纯试剂和符合GB/T 6682规定的一级水。 7.2 革兰氏阳性细菌基因组提取试剂盒。 7.3 ddPCR反应配套试剂。 7.4 无菌磷酸盐缓冲液:0.01mol/L,pH 7.2。 7.5 PMA溶液:将1mg PMA染料溶于1 mL 20%二甲基亚砜中制成1 mg/ mL的PMA储存液,置 于-20 ℃避光可保存1年。将PMA储存液用无菌水稀释10倍后作为工作液,临用前现配。 7.6 阳性对照:青春双歧杆菌标准菌株DNA,或含目的片段的DNA。 7.7 阴性对照:其他乳酸菌标准菌株DNA。 7.8 引物和探针:根据表1的序列合成引物和探针,加入超纯水配成10 μmol/L浓度,扩增序列见附 录A。 表1 青春双歧杆菌引物和探针序列 靶基因名称 引物/探针名称 序列(5’-3’) 扩增长度 hsp 60hsp 60-F TTTTCCAGCCCCGTCAAG hsp 60-R GCCACCATCAATCCGTTTG hsp 60-P FAM-ACCACGCGCGCATGGCTG-TAMRA60 bp 2SN/T5642.1—2023