̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS67.050 CCSX46 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5637—2023 6种常见黑松露成分定性检测方法 实时荧光PCR法 Qualitative detection of six species of black truffle ingredients— Real-time fluorescence PCR method 2023-11-01发布 2024-05-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:大连海关技术中心、成都海关技术中心、大连民族大学、中华全国供销合作总社昆 明食用菌研究所、拱北海关技术中心、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心。 本文件主要起草人:杨爱馥、万超、李扬、白景莲、胡江涛、郑秋月、邰丽梅、刘雪华、田卓、徐君怡、 姚丽锋、陈丽萍、蔡一村、徐杨、姜丽、林华、赵永拓、韩宏乾、梁冰、邱向锋、王琦。 ⅠSN/T5637—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 6种常见黑松露成分定性检测方法 实时荧光PCR法 1 范围 本文件规定了印度块菌(Tuber indicum Cooke &Massee)、中国块菌(T. sinense)、喜马拉雅块菌 (T. himalayense)、假凹陷块菌(T. pseudoexcavatum)、假喜马拉雅块菌(T. pseudohimalayense)和 黑孢块菌(T. melanosporum)的实时荧光PCR检测方法。 本文件适用于印度块菌、中国块菌、喜马拉雅块菌、假凹陷块菌、假喜马拉雅块菌和黑孢块菌成分的 定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403—2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适应于本文件。 3.1 黑松露 black truffle 隶属于真菌界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、盘菌纲(Pezizomycetes)、盘菌目(Pezizales)、块菌 科(Tuberaceae)、块菌属(Tuber)的一类生于地表下的块状真菌。 3.2 实时荧光PCR real-time fluorescence PCR 实时荧光聚合酶链式反应。在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测 整个PCR扩增过程,实现对起始模板的定量及定性分析。 3.3 Ct值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定域值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适应于本文件。 DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid) dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate) ITS: 核糖体内转录间隔区(internal transcribed space) 1SN/T5637—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э OD:光密度值(optical density) PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) Taq DNA聚合酶:耐热DNA聚合酶(Taq DNA polymerase) Tris:三(羟甲基)氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane) 18SrRNA:真核生物核糖体小亚基18S基因(18S ribosomal RNA) 5 方法提要 样品经研磨后,提取DNA,采用黑松露ITS基因序列的特异性引物和探针对样品DNA进行 TaqMan探针实时荧光PCR扩增,根据Ct值,判断该样品中是否存在黑松露成分。 6 试剂和材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。所有试 剂均用无DNA酶污染的容器分装。 6.1 黑松露成分扩增引物和探针序列详见表1。黑松露引物扩增的靶标序列见附录A。 表1 黑松露成分扩增引物和探针序列信息表 名称 引物/探针序列(5’-3’) 目的基因 内参照5’端引物 内参照3’端引物 内参照探针TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC-TAMRA真核生物18SrRNA基因 黑松露5’端引物 黑松露3’端引物 黑松露探针CTGTTCGAGCGTCACTACACAC TGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTA FAM-CAATATTTGTGGTCTTGGCAGGAGTGAATT-TAMRA 黑松露ITS基因 6.2 组织裂解液:20 mmol/L tris-Cl,5 mmol/L EDTA,400 mmol/L NaCl,1% (m/V) SDS, 400 μg/ml,用10 % 盐酸调pH至8.0,121 ℃,高压灭菌20 min,备用。 6.3 TE缓冲液(Tris-Cl、EDTA缓冲液):10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),1 mmol/L EDTA(pH8.0)。 6.4 蛋白酶K:20 mg/μL。 6.5 Tris饱和酚。 6.6 三氯甲烷。 6.7 异戊醇。 6.8 异丙醇。 6.9 70%乙醇。 6.10 实时荧光PCR反应混合液:12.5 μL反应体系包括1 U~3 U的Taq酶、1×PCR缓冲液、 2.5 nmol/L~4.0 nmol/L的Mg2+、0.2 nmol/L dNTP。如果具有等效的商品化试剂盒,也可使用等 效产品。 7 仪器和设备 7.1 实时荧光PCR仪。 2SN/T5637—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 7.2 离心机:转速 ≥12 000 r/min。 7.3 微量移液器:0.5 μL ~10 μL、10 μL ~100 μL、20 μL ~200 μL、100 μL~1 000 μL。 7.4 冰箱:2 ℃~8 ℃,-20 ℃。 7.5 高压灭菌器。 7.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 7.7 pH计:精密度为0.01。 7.8 天平:感量0.01 g。 7.9 恒温水浴锅:0 ℃~100 ℃。 7.10 涡旋振荡器。 7.11 研钵及粉碎装置。 8 检测步骤 8.1 DNA提取 8.1.1 将待检样品研磨成粉末,称取100 mg于1.5 mL离心管中,加入700 μL预热(56 ℃)的组织裂 解液和20 μL蛋白酶K,使用涡旋振荡器振荡混匀,56 ℃水浴30 min,期间振荡混匀。 8.1.2 12 000 r/min离心10 min,吸取上清液至新的离心管中,加等体积的Tris饱和酚∶三氯甲烷∶ 异戊醇 (25∶24∶1) 混合液,上下颠倒混匀。 8.1.3 12 000 r/min离心10 min,吸取上清液至新离心管中;加等体积的三氯甲烷∶异戊醇 (24∶1), 上下颠倒混匀。 8.1.4 12 000 r/min离心10 min,吸取上清液至新离心管中;加入0.8倍体积异丙醇,室温下沉 淀1 h~2 h。 8.1.5 12 000 r/min离心10 min,弃上清液;加入1.0 mL 70 % 乙醇倾斜离心管,轻轻转动数圈后, 12 000 r/min离心5 min,弃上清液;用70 % 乙醇按相同的方法重复洗1次,室温干燥。 8.1.6 加入50 μL TE溶解DNA沉淀,于- 20 ℃保存备用。 注: 也可采用等效的商业化DNA提取试剂盒并按照其说明制备模板DNA。 8.2 DNA浓度和纯度的测定 样品DNA使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定260 nm和280 nm处的吸收值。DNA的 浓度按照公式(1)计算。 c=A260×N×50 …………………………( 1 ) 式中: c ———DNA浓度,单位为微克每毫升(μg/mL); A260———260 nm处的吸光值; N———核酸稀释倍数。 DNA的纯度以A260/A280表示,该值在1.7~1.9之间时,适宜于实时荧光PCR检测。 8.3 实时荧光PCR检测 8.3.1 实时荧光PCR反应体系 实时荧光PCR反应体系见表2。每个样品进行检测时应设置两个平行。 3SN/T5637—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 表2 TaqMan实时荧光PCR反应体系 试剂名称 工作液浓度 加样量/μL 反应体系终浓度 PCR反应混合液(2×) 1× 12.5 1× 正向引物 10 μmol/L 1.0 400 nmol/L 反向引物 10 μmol/L 1.0 400 nmol/L 探针