̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS67.050 CCS X04 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5636—2023 16种鱼类成分定性检测方法 实时荧光PCR法 Qualitative identification of 16 fish ingredients— Real-time PCR method 2023-11-01发布 2024-05-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:大连海关技术中心、辽宁省海洋水产科学研究院、韶关学院(广东省粤北食药资源 利用与保护重点实验室)、大连民族大学、成都海关技术中心、上海海关动植物与食品检验检疫技术中 心、郑州海关技术中心、拱北海关技术中心。 本文件主要起草人:万超、杨爱馥、代弟、贾赟、蒋经伟、郑秋月、徐君怡、曹际娟、张霞、文菁、胡江涛、 蔡一村、姚丽锋、苗丽。 ⅠSN/T5636—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 16种鱼类成分定性检测方法 实时荧光PCR法 1 范围 本文件规定了大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼、北太平洋无须鳕、狭鳕、细鳞壮鳕、革平鲉、六线鱼、大黄鱼、 舌鳎、牙鲆、大菱鲆、细鳞大麻哈鱼、大西洋鲑鱼、史氏鲟、小体鲟、欧鳇的物种源性成分实时荧光PCR检 测方法。 本文件适用于大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼、北太平洋无须鳕、狭鳕、细鳞壮鳕、革平鲉、六线鱼、大黄鱼、 舌鳎、牙鲆、大菱鲆、细鳞大麻哈鱼、大西洋鲑鱼、史氏鲟、小体鲟、欧鳇源性成分的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403—2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语、定义 下列术语和定义适应于本文件。 3.1 实时荧光PCR real-time fluorescence PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。 3.2 Ct值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适应于本文件。 DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid) dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate) OD:光密度值(optical density) PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) COX1:细胞色素氧化酶1(cytochrome c oxidase subunit 1) Taq DNA 聚合酶:耐热DNA聚合酶(Taq DNA polymerase) Tris:三(羟甲基)氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane) ND1:NADH 脱氢酶亚基1(NADH dehydrogenase subunit 1) 1SN/T5636—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 18SrRNA:真核生物核糖体小亚基18S基因(18S ribosomal RNA) 5 方法提要 本文以TaqMan探针法和SYBR Green染料法两种荧光PCR法,针对鱼类线粒体COX1等基因 设计特异性引物(探针),针对样品DNA进行实时荧光PCR扩增,根据Ct值,判断该样品中是否存大 西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼、北太平洋无须鳕、狭鳕、细鳞壮鳕、革平鲉、六线鱼、大黄鱼、舌鳎、牙鲆、大菱鲆、 细鳞大麻哈鱼、大西洋鲑鱼、史氏鲟、小体鲟、欧鳇成分。 6 试剂和材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。所有试 剂均用无DNA酶污染的容器分装。 6.1 检测用引物(对)序列和探针: 大西洋鳕鱼、北太平洋无须鳕、革平鲉等11种鱼类成分SYBR Green实时荧光PCR法引物序列见表1,太平洋鳕鱼、狭鳕等5种鱼类TaqMan探针实时荧光PCR法 引物探针序列见表2。 表1 11种鱼类SYBR Green实时荧光PCR法引物序列 名称 引物序列(5’-3’) 目的基因 内参照:真核生物 18SrRNA5‘-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’ 5‘-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’18S 大西洋鳕鱼 Gadus morhua5‘-AATCTTAATACTTCTTTCTTTGAC-3’ 5‘-CTCAGACTATACCCATATACC-3’COX1 北太平洋无须鳕鱼 Merluccius productus5‘-GTCACGGCACACGCCTTC-3’ 5‘-GGAGGAGCAGGAACGATGG-3’COX1 革平鲉 Sebastes alutus5‘-AGCATCAGTCGACCTGACAATC-3’ 5‘-GCAGCAAGAACTGGTAGAGAGAGA-3’COX1 六线鱼 Hexagrammos otakii5‘-AAGCATAGTAATACCCGCAGCAAG-3’ 5‘-CCGCCATTTCTCAGTACCAAACC-3’COX1 大黄鱼 Larimichthys crocea5‘-AACAGGTAGTGAGAGCAGCAGGAG-3’ 5‘-CGGCATCACCCAATATCAAACACC-3’COX1 舌鳎 Cynoglossus5‘-AAGATTGTTAGGTCTACGGAAGC-3’ 5‘-CTACTACTACTTGCCTCATCTGC-3’COX1 牙鲆 Paralichthys olivaceus5‘-AAACAGGTGTTGGTAGAGGATTGG-3’ 5‘-CAATACTGCTTACAGACCGAAACC-3’COX1 大菱鲆 Scophthalmus maximus5‘-ACCAAATTCCCCTGTTCGTATGAG-3’ 5‘-GGGTCAAAGAAAGCGGTGTTG-3’COX1 史氏鲟 Acipenser schrencki5‘-ATGGGACACCCCGCTACTC-3’ 5‘-GCGAATACAGCTCCTATCGATAAC-3’COX1 2SN/T5636—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 表1 11种鱼类SYBR Green实时荧光PCR法引物序列 (续) 名称 引物序列(5’-3’) 目的基因 小体鲟 Acipenser ruthenus5‘-ACTTCTCCTATTATCGCTACC-3’ 5‘-TAGAATTAGAATATACACCTCTGG-3’COX1 欧鳇 Acipenser huso5‘-TTCACAGGTTATACACTACACG-3’ 5‘-AGGAGACGGTATTTCACAGG-3’OX1 表2 5种鱼类TaqMan探针实时荧光PCR法引物、探针序列 名称 引物/探针序列(5’- 3’) 目的基因 内参照:真核生物 18SrRNA5‘-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’ 5‘-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’ FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-TAMRA18S 太平洋鳕鱼 Gadus macrocephalus5‘-CGGCTCTCTAATTTCTCTAATGGC-3’ 5‘-CACCCGTGGAGTCACTCAAC-3’ FAM-TGAGAAGCCTTCGCTGCCAAACGG-TAMRACOX1 狭鳕 Theragra chalcogramma5‘-TACAACTCAAGAAGCAACATGGC -3’ 5‘-CCGATTTGTTTCTGCTAGTGTGG-3’ FAM-CGCCCTCCCAGCATGACCCTTAGC-TAMRAND1 细鳞壮鳕 Albatrossia pectoralis5‘-AATTTGATCGTCGCCCAGGAG-3’ 5‘-GTGCCTGAGCCGGAATAGTG-3’ FAM-ATCCGAGCCGAACTCAGCCAGCCT-TAMRACOX1 细鳞大麻哈鱼 Oncorhynchus tshawytscha5‘-TTCGGTCCGTGAGCAACATAG-3’ 5‘-TTGTTTGAGCTGTGCTAATCACTG-3’ FAM-TCCCTCCCCGTTCTGGCAGCAGG-TAMRACOX1 大西洋鲑鱼 Salmo salar5‘-ACGAAGGCATGGGCTGTAAC-3’ 5‘-GCACCGCCCTAAGTCTCTTG-3’ FAM-TCGAGCAGAACTCAGCCAGCCTGG-TAMRACOX1 6.2 裂解液:20 mMol/L tris-Cl,5 mMol/L EDTA,400 mMol/L NaCl,1%(m/V) SDS,400 μg/mL, 用10%盐酸调pH至8.0,121 ℃,高压灭菌20 min,备用。 6.3 TE缓冲液(Tris-Cl、EDTA