̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS71.100.70 CCSY42 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5560—2023 化妆品光毒性试验 光反应性的测定 活性氧试验 Cosmetics phototoxicity test—Reactive oxygen species assay for photoreactivity 2023-05-05发布 2023-12-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国广州海关。 本文件主要起草人:温巧玲、潘芳、席静、黄丽霞、陈德明、黄雄俊、潘丙珍、易蓉、董洁、陈文锐。 ⅠSN/T5560—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 化妆品光毒性试验 光反应性的测定 活性氧试验 1 范围 本文件规定了化妆品光毒性试验的活性氧试验测定光反应性的试验方法。 本文件适用于化妆品组分体外光毒性的筛选评价。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 OECD TG 495:2019 活性氧试验测定光反应性 Ros (Reactive Oxygen Species) Assay for Pho- toreactivity 3 术语与定义 下列术语与定义适用于本文件。 3.1 光毒性 phototoxicity 皮肤一次接触化学物质后,继而暴露于紫外线照射下所引发的一种皮肤毒性反应,或者全身应用化 学物质后,暴露于紫外线照射下发生的类似反应。这些光毒性包括光刺激性、光过敏性和光遗传毒性。 3.2 光反应性 photoreactivity 化学物质由于吸收光子而与另一个分子发生反应的性质。 3.3 辐照度 irridance 照射到某一表面上的紫外线或可见光的强度,单位为W/m2或mW/cm2。 3.4 光照剂量 dose of light 照射到某一表面上的紫外线或可见光的总量[=强度×时间(秒)],单位为J/m2或J/cm2。 3.5 活性氧种类 Reactive Oxygen Species,ROS 活性氧种类,包括超氧阴离子(SA)和单线态氧(SO)。 3.6 超氧阴离子 superoxide anion,SA 超氧阴离子是化学物质经光照射后通过Ⅰ型光化学反应产生的一种自由基。 1SN/T5560—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 3.7 单线态氧 singlet oxygen,SO 单线态氧是化学物质经光照射后通过Ⅱ型光化学反应产生的一种自由基。 4 方法原理 4.1 概述 化妆品的某些组分具有光反应性,这些化学物质本身无毒,但暴露于紫外线光下时会对皮肤或眼睛 具有光毒性。其主要机制是这些光反应性化学物质吸收能诱导发色团激发的某一波长的光子,激发能 量转移到氧分子上,发生光化学反应,生成ROS(包括光激发分子通过Ⅰ型光化学反应生成的SA和通 过Ⅱ型光化学反应生成的SO)。ROS试验(活性氧试验)是对化学物质光反应性进行定性评估的方法, 其原理基于测定化学物质经太阳光模拟器照射后生成的ROS,包括SA和(或)SO,该试验可用于化学 物质(如化妆品组分)体外光毒性的筛选评价。 4.2 SO测定原理 4.2.1 咪唑环捕获SO,生成能诱导RNO发生脱色反应的反式过氧化物中间体,如下所示: SO+咪唑→【过氧化物中间体】→氧化咪唑【过氧化物中间体】+RNO→RNO+产物 4.2.2 SO测定原理是通过分光光度法测定对亚硝基二甲基苯胺(RNO)脱色反应检测SO,即在440 nm 处检测RNO的吸光度值降低。 4.3 SA测定原理 4.3.1 SA可通过单电子转移反应还原NBT,生成稳定的中间体———部分还原的(2e-)单甲臜(NBT+), 即SA可将NBT还原为NBT+,如下所示: SA+ NBT → O2+ NBT+ 4.3.2 SA测定原理是通过分光光度计测定硝基蓝四氮唑(NBT)的还原检测SA,即在560 nm处检测 吸光度值变化。 5 主要设备 5.1 酶标仪。 5.2 光源(太阳光模拟器) ROS的生成受温度影响,太阳光模拟器应配备温度控制器或风扇以保持照射期间的温度(标准温 度为25 ℃),照射期间温度可控制在20 ℃~29 ℃之间。可使用以下两类太阳模拟器: a) 配备可减少<290 nm波长紫外线过滤器的太阳能模拟器,辐照度和光照剂量如下: ———1.8 mW/cm2~2.2 mW/cm2照射1 h (例如,Atlas Suntest CPS+或CPS,CPS+的指示 器设定值为250 W/m2或等效产品) ; ———UVA光照剂量:6.5 J/cm2~7.9 J/cm2。 b)配备可减少<300 nm波长紫外线过滤器的太阳能模拟器,辐照度和光照剂量如下: ———3.0 mW/cm2~5.0 mW/cm2照射1 h(例如,Seric SXL-2500V2或等效产品) ; ———UVA光照剂量:11 J/cm2~18 J/cm2。 5.3 UVA紫外照度计。 5.4 石英反应容器 2SN/T5560—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 5.4.1 可使用带高紫外线透射率的盖子或密封件的其他容器。使用其他容器时,可使用附录A中的 参考化学物质(序号1-17)进行可行性研究,以选择合适的紫外线和可见光照射剂量。 5.4.2 使用石英反应容器可避免紫外线穿过塑料盖造成损失,并避免反应混合物蒸发。推荐容器的规 格见附录B。 5.5 可调微量移液器:200 μL、1 000 μL。 5.6 超声仪。 5.7 涡旋混匀器。 5.8 显微镜。 5.9 数显温度计。 5.10 冰箱:2 ℃~8 ℃,-20 ℃。 5.11 精密电子天平:感量0.000 01 g。 6 试验准备 6.1 试剂 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂,实验用水符合GB/T 6682一级水的要求。所有配制的 试剂应在制备后1个月内使用,并在使用前进行超声混匀处理。 6.1.1 20 mmol/L磷酸钠缓冲液(NaPB),pH 7.4 将0.593 g NaH2PO4·2H2O(CAS No.13472-35-0)和5.80 g Na2HPO4·12H2O(CAS No. 10039-32-4),加900 mL一级水,用1 mol/L HCl溶液调pH值至7.4后,再用一级水稀释至1 000 mL, 然后搅拌均匀。放入冰箱2 ℃~8 ℃冷藏或在室温下储存。 6.1.2 0.2 mmol/L对亚硝基二甲基苯胺(RNO,CAS No.138-89-6) 将0.003 g RNO溶于100 mL 20 mmol/LNaPB中。放入冰箱中2 ℃~8 ℃冷藏避光储存。 6.1.3 0.2 mmol/L咪唑(CAS No.288-32-4) 将0.013 6 g咪唑溶解在10 mL的20 mmol/LNaPB中制成20 mmol/L咪唑溶液。将20 mmol/L 咪唑溶液用20 mmol/LNaPB稀释100倍,即得0.2 mmol/L咪唑溶液。配制好的0.2 mmol/L咪唑溶 液放入冰箱中2 ℃~8 ℃冷藏避光储存。 6.1.4 0.4 mmol/L硝基蓝四氮唑(NBT,CAS No.298-83-9) 将0.032 7 g NBT溶于100 mL 20 mmol/L NaPB中。放入冰箱中2 ℃~8 ℃冷藏避光储存。 6.2 待测化学物质溶剂选择和溶液配制 6.2.1 溶剂选择 待测化学物质应配成溶液后进行测试,且待测化学物质不应与所选溶剂发生反应。溶剂首选分析 纯二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)。对于不溶于DMSO的化学物质,使用20 mmol/L NaPB 作为溶剂。当待测化学物质在DMSO或NaPB中不溶或不稳定时,可使用其他溶剂,但应确保待测化 学物质在所选溶剂中是稳定的,并且参考化学物质的SO值和SA值在附录A规定的范围内。 6.2.2 待测化学物质溶液配制 6.2.2.1 待测化学物质的分子量应是已知的。 3SN/T5560—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 6.2.2.2 溶液配制期间,所有溶液均应避免强紫外线和强可见光照射(例如,避免在直接照射的头顶灯 下或有自然光照射的窗户附近工作)。 6.2.2.3 待测化学物质应用6.2.1中的溶剂现配现用。一般以200 μmol/L为最终浓度进行测试。 如果200 μmol/L的反应混合物在照射前发生沉淀、着色或其他干扰实验的情况,则可以20 μmol/L为 最终浓度进行测试。当待测化学物质在20 μmol/L浓度时测得阳性结果,表明该物质具有光反应性; 但当浓度低于20 μmol/L时出现阴性结果,不一定代表该物质无光反应性。 6.2.2.4 将每种待测化学物质称量在试管中,加入溶剂配成10 mmol/L溶液。然后将试管置于涡旋 混匀