̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS65.020.01 CCSB16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5558—2022 转基因香石竹(康乃馨)检测 普通PCR和实时荧光PCR法 Detection of genetically modified carnation (Dianthus caryophyllus) conventional PCR and real-time PCR methods 2022-07-07发布 2023-02-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件部分方法参考了欧盟联合研究中心转基因食品及饲料欧洲联合参考实验室(European Union Reference Laboratory for Genetically Modified Food and Feed,the Joint Research Centre of the European Commission)和ISO 21570:2005已验证的方法。一致性程度为非等效。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、中国检验检疫科学研究院。 本文件主要起草人:李想、尹璐、付伟、左翠花、印丽萍、郭德华、戚龙君、叶军。 ⅠSN/T5558—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 转基因香石竹(康乃馨)检测 普通PCR和实时荧光PCR法 1 范围 本文件规定了香石竹(康乃馨)中转基因成分的普通PCR和实时荧光PCR检测方法。 本文件适用于香石竹(康乃馨)中转基因成分的定性筛选检测,也适用于转基因香石竹(康乃馨) MoonberryTM 25958、MoonvelvetTM 26407、MoonliteTM 123.2.38 (40644)和MoonshadeTM 123.2.2 (40619)品系的品系特异性定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T 19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 GB/T 19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 香石竹(康乃馨) Dianthus caryophyllus 石竹科石竹属多年生草本植物。香石竹在全世界范围广泛种植,是四大鲜切花之一,也可提取香精 用做化妆品原料。 3.1.2 转基因 transgene 将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列,通过生物工程技术,使其在该物种中进 行表达,以便使该物种获得新的品种特征。 3.1.3 实时荧光 PCR real-time polymerase chain reaction 实时荧光聚合酶链式反应。是指在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时 监测整个PCR进程,荧光信号的强弱直接反映模板数量。 3.1.4 内源基因 endogenous gene 在被检测物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因,一般为该物种特有基因。该基因可用 1SN/T5558—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 于判定物种特异性。 3.1.5 外源基因 exogenous gene 利用生物工程技术转入的其他物种的基因。 注: 转入外源基因后,该生物品种表现新的生物学性状。 3.1.6 最低检出限 limit of detection 定性方法的最低检出限是指被检测物能被可靠检出的最低浓度或含量。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ANS:anthocyanidin synthase gene,花青素合成酶基因; BHQ1:Black hole quencher 1,黑洞猝灭基团1。 bp:base pair,碱基对。 BP40:Flavonoid 3’,5’-hydroxylase (F3’5’H) enzyme of Viola wittrockiana,三色堇黄烷酮3’, 5’-羟化酶基因。 CHS:chalcone synthase gene promoter,查尔酮合成酶基因启动子。 Ct:Cycle threshold,每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 CTAB:cetyltrithylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵。 DFR:dihydroflavonol-4-reductase terminator,二氢黄酮醇-4-还原酶基因终止子。 DNA:deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸。 dATP:deoxyadenosine triphosphate,脱氧腺苷三磷酸。 dCTP:deoxycytidine triphosphate,脱氧胞苷三磷酸。 dGTP:deoxyguanosine triphosphate,脱氧鸟苷三磷酸。 dNTP:deoxyribonucleoside triphosphate,脱氧核苷三磷酸。 dTTP:Deoxythymine triphosphate,脱氧胸腺嘧啶三磷酸。 EDTA:ethylene diaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸。 F35H:Flavonoid 3’,5’-hydroxylase (F3’5’H) enzyme of Petunia hybrida,矮牵牛黄烷酮3’, 5’-羟化酶基因。 FAM:Carboxyfluorescein,羧基荧光素。 PCR:polymerase chain reaction,聚合酶链式反应。 SURB:herbicide tolerant acetolactate synthase (ALS) enzyme,抗除草剂型乙酰乳酸合酶基因。 SDS:sodium dodecylsulfate,十二烷基磺酸钠。 pCaMV 35S:35S promoter from Cauliflower mosaic virus,来自于花椰菜花叶病毒的35S启动子。 Taq:Taq DNA polymerase,DNA聚合酶。 TE:Tris-HCl、EDTA缓冲液。 Tris:tris (hydroxymethyl) aminomethane,三(羟甲基)氨基甲烷。 4 方法原理 提取样品DNA后,采用普通PCR或实时荧光PCR技术对样品进行筛选基因检测,根据普通PCR 电泳结果或实时荧光PCR扩增曲线的情况,判断样品中是否含有转基因成分。 对筛选基因检测阳性的样品,或已知为转基因阳性的样品,如需进行品系鉴定,则采用标准中的品 2SN/T5558—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 系特异性方法进行检测。根据普通PCR电泳结果或实时荧光PCR扩增曲线的情况,判断样品中含有 哪些转基因香石竹品系。 5 仪器设备与试剂 5.1 仪器设备 5.1.1 实时荧光PCR仪。 5.1.2 普通PCR仪。 5.1.3 样品粉碎仪或研磨机。 5.1.4 天平:感量0.01 g。 5.1.5 水浴锅或恒温孵育器。 5.1.6 冷冻离心机。 5.1.7 高压灭菌锅。 5.1.8 涡旋振荡器。 5.1.9 生物安全柜。 5.1.10 pH计。 5.1.11 紫外分光光度计。 5.1.12 微量移液器(2.5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL)。 5.2 主要试剂 除特别说明外,所有试剂均为分析纯或生化试剂,实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。 5.2.1 样品DNA提取纯化试剂 5.2.1.1 1 mol/L Tris·HCl,pH8.0 称取121.1 g Tris,溶于800 mL水中,搅拌,加入浓盐酸42 mL,冷却至室温,用稀盐酸准确调整 pH至8.0,分装后高压灭菌备用。 5.2.1.2 0.5 mol/L Na2-EDTA·2H2O,pH8.0 在800 mL H2O中加入186.1 g Na2-EDTA·2H2O,在磁力搅拌器剧烈搅拌,用NaOH调节pH 值至8.0(约需20 g NaOH颗粒),然后定容至1 L,分装后高压灭菌备用。 5.2.1.3 DNA抽提缓冲液 量取100 mL 1 mol/L Tris·HCl,50 mL 0.5 mol/L Na2-EDTA·2H2O,称取5.0 g SDS,16.848 g NaCl,定容至1 L,分装后高压灭菌备用。 5.2.1.4 Tris 饱和酚 5.2.1.5 氯仿 5.2.1.6 异丙醇 5.2.1.7 70%乙醇 5.2.1.8 TE缓冲液 量取10 mL 1 mol/L Tris·H