̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э I C S6 5.0 2 0.2 0 C C SB1 6 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/T5 5 4 6—2 0 2 2 欧洲樱桃绕实蝇检疫鉴定方法 D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f R h ago l e t i s c e r a s i (L i n n a e u s ) 2 0 2 2-0 7-0 7发布 2 0 2 3-0 2-0 1实施 中华人民共和国海关总署 发 布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 欧洲樱桃绕实蝇检疫鉴定方法 S N/T5 5 4 6—2 0 2 2 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲 1号(1 0 0 0 2 3) 编辑部: (0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2 - 7 5 3 0 网址www. c u s t o m s k b. c o m /b o o k 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本8 8 0×1 2 3 0 1 /1 6 印张1. 2 5 字数3 8千字 2 0 2 3年1月第一版 2 0 2 3年1月第一次印刷 印数1—5 0 0 * 书号:1 5 5 1 7 5·9 1 6 定价2 1.0 0元̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照 G B/T 1. 1—2 0 2 0《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 :中华人民共和国满洲里海关 、中国检验检疫科学研究院 、中华人民共和国广州海 关、中华人民共和国二连海关 、中华人民共和国呼和浩特海关 。 本文件主要起草人 :刘玮琦、陈超、姜帆、梁帆、张永宏、郑敏、耿俊东、杨东来、邢磊、刘文敏、王旭、 陈树华。 ⅠS N/T5 5 4 6—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 欧洲樱桃绕实蝇检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了欧洲樱桃绕实蝇 R h ago l e t i s c e r a s i (L i n n a e u s ,1 7 5 8)的检疫鉴定方法 。 本文件适用于植物及植物产品中欧洲樱桃绕实蝇的检疫和鉴定 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本 (包括所有的修改单 )适用于 本文件。 S N/T 1 8 8 3 苹果实蝇检疫鉴定方法 S N/T 1 8 4 7 寡毛实蝇类害虫分类学术语 3 术语和定义 S N/T 1 3 8 3和S N/T 1 8 4 7界定的术语和定义适用于本文件 。 4 欧洲樱桃绕实蝇基本信息 学名:R h ago l e t i s c e r a s i (L i n n a e u s ,1 7 5 8) 。 异名:Mu s c a c e r a s i(L i n n a e u s ,1 7 5 8) ,R h ago l e t i s fa s c i a t a (R o h d e n d o r f ,1 9 6 1) ,R h ago l e t i s n ig- r ipe s (R o h d e n d o r f ,1 9 6 1) ,R h ago l e t i s o b s o l e t a (H e r i ng,1 9 3 6) ,T eph r i t i s c e r a c i (P e r s s o n ,1 9 5 8) , T ry pe t a s ign a t a (M e ige n,1 8 2 6) ,U r oph o r a c e r a s o r u m (D u f o u r,1 8 4 5) ,U r oph o r a l i t u r a t a (R o b i n e a u - D e s v o i dy,1 8 3 0) 。 英文名:E u r ope a n c h e r ry f r u i t f ly,c h e r ry f r u i t f ly,c h e r ry m ag go t。 其他中文名称 :欧洲樱桃实蝇 ,樱桃绕实蝇 。 分类地位 :双翅目D ipt e r a,实蝇科T eph r i t i d a e,绕实蝇属 R h ago l e t i s。 传播途径 :成虫具有一定的飞行能力 ,可进行近距离传播 。成虫、幼虫、卵随寄主果实和运输工具远 距离传播 ,老熟幼虫 、蛹可随土壤 、介质等进行远距离传播 。 欧洲樱桃绕实蝇的其他信息参见附录 A。 5 方法原理 根据欧洲樱桃绕实蝇的为害状 ,在检疫现场发现疑似欧洲樱桃绕实蝇为害的果实 ,获取卵、幼虫、蛹 或成虫等样本 ,卵、幼虫或蛹须饲养至成虫后制作成针插标本 ,置于体视显微镜下观察 ,依据成虫的形态 特征对种类进行鉴定 。也可利用欧洲樱桃绕实蝇特异性扩增引物的常规 P C R检测方法和实时荧光 P C R检测方法 ,对欧洲樱桃绕实蝇进行种类判定 。 1S N/T5 5 4 6—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 6 器材和试剂 6.1 器材 可封口塑料袋 、标签、培养皿、吸水纸、镊子、小毛笔、指形管、纱布、冰箱、三角纸、剪刀、昆虫针、滴 管、培养皿、载玻片、盖玻片、体视显微镜 、荧光定量 P C R仪、P C R仪、冷冻混合球磨仪 、超净工作台 、电 泳仪、凝胶成像分析仪 、核酸蛋白检测仪 、微量组织捣碎仪 、高速冷冻离心机 、研磨机、台式小型离心机 、 制冰机、旋涡震荡器 、移液器、电子天平 、pH计、水浴锅、生物培养箱 、纯水仪、高压灭菌器 、超低温冰 箱等。 6.2 试剂 醋酸钾、双蒸馏水 、液氮、蛋白酶K(2 0 mg/mL) 、RNA消化酶、T r i s饱和酚、P r e m i x E x T aq(2×) 、 三氯甲烷 、异戊醇、异丙醇、7 5%乙醇、9 5%乙醇、1 0 0%乙醇、1 0×P C R 缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸 (d NT P s) 、T aq酶、DNA M a r k e r、琼脂糖、G o l d V i e w型核酸染色剂 (5 0 0 0×) 、引物探针 、昆虫基因组 DNA提取试剂盒 、白砂糖、啤酒酵母 、苯酚、氢氧化钠 (钾)等。 提取液A:1% S D S,5 0 mm o l/L T r i s·C l(pH 8. 0) ,2 5 mm o l/L N a C l,2 5 mm o l/L E D T A(pH 8. 0) 。 7 现场检疫 仔细检查果实表面有无产卵痕迹 ,或果实是否有腐软的现象 ,剖果检查是否有蛆状幼虫 。将染虫果 或者怀疑带虫的果实进行培养观察 。欧洲樱桃绕实蝇为害状参见附录 B。 8 实验室鉴定 8.1 形态学鉴定 8.1.1 饲养 8.1.1.1 卵或幼虫的饲养 将现场采取的卵或幼虫部分个体制成鉴定标本 ,其余个体继续用原寄主果实培养 。具体的培养方 法是:将带有卵或幼虫的寄主果实放在小号白瓷盘里 ,然后将小号白瓷盘放在装有自来水的大号白瓷盘 内,再用防虫网罩住小号白瓷盘 ,罩的下方边缘浸没于大号白瓷盆内的水中 。置于温度为 2 0 ℃~2 5 ℃,湿 度为3 0%~6 0% 的生物培养箱中饲养至幼虫老熟 。 8.1.1.2 蛹的饲养 取一盛有洁净细砂的养虫杯 (沙子厚度 1 0 c m,含水量5%~1 0% ) ,将现场检疫收集的或室内培养 得到的围蛹埋于距细砂表面 3 c m~5 c m处(若是老熟幼虫则可直接将其置于细砂表面 ,幼虫将钻入沙 中化蛹) 。将养虫杯放置于 5 ℃以下的冰箱中冷藏 1 8 0 d左右,取出养虫杯置于温度为 2 2 ℃~2 5 ℃,湿 度为3 0%~6 0% 的生物培养箱中饲养 ,直至成虫羽化 。 8.1.1.3 成虫的饲养 成虫羽化后 ,悬挂相应寄主果实切片于养虫箱内供其取食 ;或将白砂糖和啤酒酵母按照 1∶2质量 比混合制成饲料放入小容器中喂养 ,此外,在培养皿中放入几张滤纸 ,加适量的水浸透滤纸供成虫饮用 。 2S N/T5 5 4 6—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 待成虫斑纹的色泽和大小稳定 (约3 d~5 d )后,收集成虫并置于冰箱冷冻层 (约-2 0 ℃) 0. 5 h~1 h, 杀死,待鉴定。 8.1.2 标本的预处理 8.1.2.1 成虫还软处理 如果成虫虫体已干硬 ,在制作标本前应进行还软处理 。具体方法是 :取一小型干燥器 ,加入干净细 砂约2 c m,加水至漫过细砂表面约 1 c m,并滴加数滴苯酚以防标本腐烂 ,上层放待还软的成虫标本 ,密 封室温放置 。 8.1.2.2 成虫标本制备 借助三级台将昆虫针插入三角纸尖角近处 ,然后将针尖端从成虫中胸的腹面插入 ,再用昆虫针插入 三角纸另两个角中央近边缘处 ,固定,插上相应的标签 。 8.1.2.3 幼虫封片标本制备 用昆虫针在幼虫体壁上刺戳数个小孔 ,置于1 0%氢氧化钠 (或1 0%氢氧化钾 )溶液中浸泡 1 2 h (或 煮沸3 m i n)后取出,用解剖针将幼虫体中的残留物挤压出并用蒸馏水洗净 :在体视显微镜下挑取口钩 、 前气门和后气门等部