̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS65.020.20 CCSB16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5528—2022 大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Barley stripe mosaic virus 2022-07-07发布 2023-02-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国广州海关、广东杰信检验认证有限公司、中华人民共和国上海 海关。 本文件主要起草人:冯黎霞、魏霜、李献锋、于璇、武目涛、赵立荣、黄璐、于翠、杨翠云。 ⅠSN/T5528—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了大麦条纹花叶病毒DAS-ELISA、普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR检疫鉴定方法。 本文件适用于籽粒、花粉、种苗及其他植物产品中大麦条纹花叶病毒的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 大麦条纹花叶病毒基本信息 学名:Barley stripe mosaic virus。 异名:Barley false stripe virus,Barley mild stripe virus,Barley mild stripe mosaic virus,Barley mosaic virus,Barley stripe mosaic hordeivirus,Oat stripe mosaic virus。 缩写:BSMV。 分类地位:RNA病毒域(Riboviria),正RNA病毒界(Orthornavirae),黄病毒门(Kitrinovirico- ta),甲型超群病毒纲(Alsuviricetes),马泰利病毒目(Martellivirales),植物杆状病毒科(Virgaviri- dae),大麦病毒属(Hordeivirus)。 大麦条纹花叶病毒的其他信息参见附录A。 5 方法原理 大麦条纹花叶病毒的血清学和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据BSMV与抗体之间的 特异性反应,对植物样品进行双抗体夹心免疫酶联吸附测定(DAS-ELISA);根据BSMV的基因组特征 建立RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法。 6 仪器用具与试剂 6.1 仪器 微量天平、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱(4 ℃)、超低温冰箱、高压灭菌锅、pH计、超 1SN/T5528—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 净工作台、酶标仪、洗板机、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析仪。 6.2 用具 移液器(最大量度分别为1 000 μL、200 μL、100 μL、10 μL、2.5 μL)、酶联板、离心管(1.5 mL、 0.2 mL)、研磨用具(研钵研杵或小型料理机)。 6.3 主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T 6682中相关规定。 DAS-ELISA试剂详见附录B。 RT-PCR检测试剂详见附录C。 实时荧光RT-PCR检测试剂详见附录D。 7 制备检测样品 7.1 籽粒 7.1.1 直接制备 籽粒抽样按照SN/T 2122的规定执行。 根据酶联免疫测定和分子生物学检测不同的样品制备需求,随机取样或者挑选畸形、生长不成熟的 籽粒直接制备检测样品。 7.1.2 育苗取样 随机取样或挑选外观不正常的籽粒播撒在铺有无菌滤纸的培养盘中,培养过程中滤纸需一直保持 湿润状态,或将挑选的籽粒浸泡萌芽后播种在无菌土中,培养观察。待长出完全舒展的叶片后,将表现 有BSMV疑似症状的植株单独编号,未表现BSMV疑似症状的植株分组(10~20株为1组)并编号,根 据需要分别用于酶联免疫测定和分子生物学检测。 7.2 种苗 有症状(如叶片花叶、条斑、坏死等)的植株,每个植株进行单独编号检测。无症状植株分组并编号 后进行检测,分组和检测方法参照7.1.2。 7.3 其他植物产品 无症状或无法观察症状的其他植物产品,参照SN/T 2122中规定的抽样方法进行抽样,分组编号 方法和检测方法参照7.1.2。 8 检测鉴定 8.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA) 将制备的样品上清液加入包被有BSMV抗体的酶联板中,进行DAS-ELISA检测,每个样品至少 设置1个重复。健康的植物组织作为阴性对照,感染有BSMV的植物组织作为阳性对照,样品提取缓 冲液作为空白对照,其中阴性对照的植物种类和材料(如叶片)应尽量与检测样品一致。具体操作详见 附录B。 2SN/T5528—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 8.2 RT-PCR检测 RT-PCR检测的阴性对照、阳性对照设置同8.1,灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照 的总RNA,反转录合成cDNA后进行PCR检测,具体操作详见附录C。也可以使用商品化RT-PCR一 步法试剂盒进行检测。 8.3 序列测定 RT-PCR产物回收后,进行序列测定,并将测定的序列与已知的BSMV序列进行比对分析。 8.4 实时荧光RT-PCR检测 实时荧光RT-PCR检测的阴性对照、阳性对照和空白对照设置同8.2。分别提取样品和对照的总 RNA,反转录合成cDNA后进行PCR检测,具体操作见附录D。如采用商品化一步法试剂盒,则按照 试剂盒说明进行。 9 结果判定 当检测出现以下结果时,则判定为BSMV检出,否则判定为BSMV未检出: ———当DAS-ELISA、RT-PCR、实时荧光RT-PCR3种检测方法中有两种及两种以上的检测结果呈 阳性; ———当RT-PCR检测结果为阳性,且测序结果证实其同源性符合BSMV同种间同源性要求。 10 样品保存 10.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后,未检出BSMV的样品应置于适合的条件下妥善保存3个月。检出 BSMV的样品至少保存6个月,或保存至索赔有效期满,以备复核,保存期满后应经高压灭菌后方可 处理。 10.2 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括:样品的报关单号、委托单位、名称、数(重)量、产地、接收时间、检测时间、方法 和结果等,并要有检测人员和审核人员签字。DAS-ELISA检测应有酶联反应的原始数据,RT-PCR检 测应有电泳图片,序列测定应有所测定序列的相关文件,实时荧光RT-PCR检测应有荧光曲线图谱。 11 结果复核 检验结果的复核由海关总署指定单位和人员进行,主要考察实验记录、电泳照片、测定序列信息和 荧光曲线图谱等资料的完整性和真实性,必要时进行复核实验。 3SN/T5528—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 附 录 A (资料性) 大麦条纹花叶病毒其他信息 A.1 寄主范围 B SMV自然寄主为大麦 H o r d e u m v u lga r e、小麦T r i t i c u m a e s t i v u m 、燕麦A v e n a s a t i v a、玉米Z e a mays等禾本科植物 。人工接种也可侵染甜菜 B e t a v u lga r i s、藜麦C h e n opo d i u m qu i n o a、藜C h e n opo - d i u m a l b u m、C h e n opo d i u m b e nga l e n s e、烟草N i c o t i a n a t a b a c u m 、水稻O ryz a s a t i v a、糜子P a n i c u m m i l i a c e u m 、黑麦S e c a l e c e r e a l e、高粱S o rgh u m b i c o l o r、菠菜Spi n a c i a o l e r a c e a 等。 A.2 危害症状 感染该病毒后大麦和小麦出现的症状均比较复杂 ,因品种和外界环境等因素的不同而影响症状的 出现与否 、症状类型变化及发病严重度等 。病株所结种子不饱满 ,千粒重有不同程度的降低 。典型感病 症状表现为叶片褪绿斑驳 ,深绿和浅绿相间的不规则条纹 ,黄色花叶或坏死斑块 ,整张叶片变成黄白色 。 大麦叶片会出现分散的褐色细小斑点 ,严重的则引起叶片枯死 。 图A.1 B S MV在大麦上的危害症状 (引自T h o m a s W.,1 9 8 4) A.3 分布地区 主要分布国家和地区有美国 、加拿大、阿根廷、澳大利亚 、英国、德国、法国、丹麦、波兰、前南斯拉夫 、 罗马尼亚 、俄罗斯、埃及、土耳其、也门、巴基斯坦 、日本、韩国。在中国新疆曾大面积流行过 ,目前在中国 小麦产区局部有分布 。 A.4 传播方式 病毒主要通过种子 、花粉和机械传播 ,种子传播能力与病毒株系 、感染植物所处的生理周期以及温 度有关。 A.5 粒体形态 病毒粒体为螺旋直杆状