̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э I C S0 7.1 0 0 .3 0 C C SX0 4 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/T5 5 1 6 .1—2 0 2 3 出口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换 核酸扩增 (R A A )检测方法 第1部分 :沙门氏菌 R e a l - t i m e r e c o m b i n a s e - a i d a mpl i f i c a t i o n d e t e c t i o n m e t h o d f o r pa t h oge n s i n e xpo r t f o o d—P a r t 1:S a l m o n e l l a 2 0 2 3-0 5-0 5发布 2 0 2 3-1 2-0 1实施 中华人民共和国海关总署 发 布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照 G B/T 1. 1—2 0 2 0《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 本文件是 S N/T 5 5 1 6《出口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换核酸扩增 (RAA)检测方法 》的第1 部分。S N/T 5 5 1 6已经发布了以下部分 : — — —第1部分:沙门氏菌 ; — — —第2部分:志贺氏菌 ; — — —第3部分:金黄色葡萄球菌 ; — — —第4部分:副溶血性弧菌 ; — — —第5部分:克罗诺杆菌属 ; — — —第6部分:大肠埃希氏菌 O 1 5 7; — — —第7部分:产志贺毒素大肠埃希氏菌 ; — — —第8部分:空肠弯曲菌 ; — — —第9部分:单核细胞增生李斯特氏菌 ; — — —第1 0部分:小肠结肠炎耶尔森氏菌 ; — — —第1 1部分:肺炎克雷伯氏菌 ; — — —第1 2部分:铜绿假单胞菌 ; — — —第1 3部分:蜡样芽孢杆菌 ; — — —第1 4部分:产气荚膜梭菌 ; — — —第1 5部分:霍乱弧菌 ; — — —第1 6部分:创伤弧菌 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 :中华人民共和国石家庄海关 、中华人民共和国上海海关 、石家庄学院 。 本文件主要起草人 :刘立兵、王金凤、黄新新、申进玲、王建昌、孙晓霞、陈佳、项佳林、姜彦芬、 娄巧哲。 ⅠS N/T5 5 1 6.1—2 0 2 3̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 出口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换 核酸扩增 (R A A)检测方法 第1部分:沙门氏菌 1 范围 本文件规定了出口食品中沙门氏菌的荧光重组酶介导链替换核酸扩增 (RAA)检测方法 。 本文件适用于出口食品中沙门氏菌的快速筛选 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本 (包括所有的修改单 )适用于 本文件。 G B 4 7 8 9. 4 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 G B 1 9 4 8 9 实验室 生物安全通用要求 G B/T 2 7 4 0 3 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 实时荧光 R A A r e a l t i m e R A A RAA是一种核酸恒温扩增技术 ,在恒温下 (一般为3 7 ℃-4 2 ℃) ,重组酶和寡核苷酸引物结合形 成蛋白-DNA 复合物,该复合物能够移动寻找模板 DNA中的同源序列 ,在单链DNA结合蛋白的帮助 下,打开模板 DNA的双链结构 ,在DNA聚合酶的作用下 ,形成新的双链 ,产物呈指数级扩增 。在e x o 探针中包含一个四氢呋喃残基 (THF) ,其两侧分别为 d T -荧光基团 (F AM)和d T -淬灭基团 (BHQ - 1) 。 探针3’端通过适当的修饰 (C 3 Spa c e r)被封闭,以阻止聚合酶的进一步延伸 。只有当探针和目的 DNA 结合后,核酸外切酶 I I I(E x o n u c l e a s e I I I,E x o I I I)能够识别并切除 THF残基,并解除3’端阻断,荧光基 团和淬灭基团分开并产生荧光信号 ,RAA产物与荧光信号的增长存在对应关系 。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 BHQ 1:黑洞淬灭基团 1(b l a c k h o l e qu e n c h e r 1) DNA:脱氧核糖核酸 (d e o xyr i b o n u c l e i c a c i d) d NT P:脱氧核糖核苷三磷酸 (d e o xyr i b o n u c l e o s i d e t r iph o sph a t e) E x o I I I:核酸外切酶 I I I(E x o n u c l e a s e I I I) F AM:6 -羧基荧光素 (6 - c a r b o x yf l u o r e s c e i n ) 1S N/T5 5 1 6.1—2 0 2 3̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э i n v A基因:侵袭蛋白 A(i n v a s i o n pr o t e i n A) P E G:聚乙二醇 (po lye t hyl e n e glyc o l) RAA:重组酶介导链替换核酸扩增 (r e c o m b i n a s e - a i d a mpl i f i c a t i o n ) T r i c i n e:三(羟甲基)甲基甘氨酸 (N -[T r i s(hyd r o xym e t hyl)m e t hyl] glyc i n e) 4 技术概要 以提取的 DNA为模板,采用沙门氏菌特异性 RAA引物和e x o探针,进行实时荧光 RAA的扩增, 根据实时荧光 RAA的增幅情况 ,实现对食品中沙门氏菌的快速筛选 。 5 试剂和材料 除另有规定外 ,试剂为分析纯或生化试剂 ,实验用水符合 G B/T 6 6 8 2一级水的要求 。所有试剂均 用无DNA酶污染的容器分装 。 5.1 检测用引物 (对)序列和探针 根据沙门氏菌 i n v A基因设计的上下游引物和一条 e x o探针,详见表1。 表1 引物和探针序列 名称 序列(5 ' - 3 ') 目的基因 上游引物 i n v A- F GT CATT C CATTAC C TAC C TAT C TGGTTGATTT C C 下游引物 i n v A- R G CAT C GG C TT CAAT CAAGATAAGAC GAC TGGT e x o探针i n v A- PGTAC TGG C GATATTGGTGTTTATGGGGT C GT - T (F AM) - THF - T (BHQ 1)- ACATTGACAGAAT C C - C 3 Spa c e ri n v A基因 5.2 试剂 5.2.1 细菌DNA提取试剂盒 。 5.2.2 RAA 反应缓冲液 :2 0% P E G。也可采用等效的商品试剂盒 。 5.2.3 2 8 0 mm o l/L乙酸镁。 5.2.4 冻干酶制剂 :1 mm o l/L d NT P、9 0 ng/μL单链结合蛋白 、1 2 0 ng/μL r e c A重组酶、3 0 ng/μL B s u DNA聚合酶、3 0 ng/μL E x o I I I,1 0 0 mm o l/L T r i c i n e、5 mm o l/L 二硫苏糖醇 、1 0 0 ng/μL肌酸激 酶,保存于2 0 0 μL反应管中冻干 。也可采用等效的商品试剂盒 。 5.2.5 阳性对照 :沙门氏菌标准菌株 ,或含目的片段的 DNA。 6 仪器和设备 6.1 荧光检测仪 :具有恒温 (3 9 ℃±1 ℃)扩增功能的荧光检测仪 。 6.2 微量移液器 :1 0 0 μL~1 0 0 0 μL,2 0 μL~2 0 0 μL,1 0 μL~1 0 0 μL,0. 5 μL~1 0 μL,并配备与移液 器匹配的吸头 。 6.3 高速台式离心机 :离心力≥1 2 0 0 0×g。 6.4 恒温金属浴 :1 0 0 ℃±1 ℃。 2S N/T5 5 1 6.1—2 0 2 3̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 6.5 天平:感量0. 0 1 g。 7 检测程序 食品中沙门氏菌实时荧光 RAA检测程序见图 1。 图1 食品中沙门氏菌实时荧光 R A A检测程序 8 操作步骤 8.1 样品制备 、增菌培养 按照G B 4 7 8 9. 4 的方法进行样品制备和增菌 。 8.2 细菌模板 D N A的制备 8.2.1 增菌液模板 D N A的制备 对于8. 1获得的增菌液 ,吸取1 mL菌液加入 1. 5 mL离心管中 ,1 2 0 0 0×g离心2 m i n,弃上清。 采用试剂盒中的细菌悬浮液重悬细菌 ,并按照细菌 DNA提取试剂盒说明书制备模板 DNA。 3S N/T5 5 1 6.1—2 0 2 3̾ൣय