̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS07.100.30 CCS X04 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5514—2023 出口食品中产毒素真菌快速检测方法 实时荧光PCR法 Rapid detection of mycotoxigenic fungi in export food— Real-time PCR method 2023-11-01发布 2024-05-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 出口食品中产毒素真菌快速检测方法 实时荧光PCR法 SN/T 5514—2023 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023) 编辑部:(010)65194242-7530 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张0.75 字数21千字 2024年4月第一版 2024年4月第一次印刷 印数 1—500 * 书号: 155175·1040 定价16.00元̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国海关科学技术研究中心、大连民族大 学、中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国大连海关。 本文件主要起草人:冯家望、姚丽锋、王小玉、蔡教英、游淑珠、曾静、张晓峰、丁琦、曾文祥、曾俊洁、 郑秋月、苗丽、李可、黎财慧、刘陆。 ⅠSN/T5514—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 出口食品中产毒素真菌快速检测方法 实时荧光PCR法 1 范围 本文件规定了食品中产毒素真菌的实时荧光PCR方法。 本文件适用于食品中产黄曲霉毒素的黄曲霉和寄生曲霉、产玉米赤霉烯酮毒素禾谷镰刀菌、产单端 孢霉烯族毒素禾谷镰刀菌的实时荧光PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB 4789.15 食品卫生微生物学检验 霉菌和酵母菌计数 GB 4789.16 食品卫生微生物学检验 常见产毒霉菌的鉴定 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光PCR real time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。 3.2 CT值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 aflR:产黄曲霉毒素调控基因(aflatoxin biosynthesis regulatory gene) Ct值:每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数(C:Cycle,t:threshold) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) dATP:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate) dCTP:脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidine triphosphate) dGTP:脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate) dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate) 1SN/T5514—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э dTTP:脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphate) dUTP:脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridine triphosphate) EDTA:乙二胺四乙酸(eathylene diamine tetraacetic acid) FAM:6-羧基荧光素(6-carboxy fluorescein) ITS:内部转录间隔区(internal transcribed spacer) omt-1:柄曲霉素转甲氧基霉基因(sterigmatocystin o-mcthyltransfcrase gene) PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) PKS13:聚酮合成酶基因(polyketone synthase gene) SDS:十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate) Tri5:单端孢霉烯前体合成酶基因trichodiene synthase gene Tris:三(羟甲基)氨基甲烷(tris(hydroxy methyl)aminomethane) UNG:尿嘧啶N-糖基化酶(uracil N-glycosylase) ver-1:杂色曲霉素A脱氢酶基因(versicolorin A dehydrogenase gene) 5 方法原理 本方法选用黄曲霉毒素生化合成过程中的三个关键基因:产黄曲霉毒素调控基因aflR,柄曲霉素转 甲氧基酶基因omt-1和杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1的有无来判断待检菌株是否能够产生黄曲霉毒 素;选用单端孢霉烯前体合成酶基因Tri5的有无来判断待检菌株是否能够产生单端孢霉烯族毒素;选 用聚酮合成酶基因PKS13的有无来判断待检菌株是否能够产生玉米赤霉烯酮毒素。另外,使用真菌共 有的5.8SrRNA的ITS序列作为内标基因。 6 主要设备及耗材 6.1 天平:感量0.1 g。 6.2 均质器。 6.3 恒温摇床:25 ℃± 1 ℃。 6.4 高速台式冷冻离心机(离心力12 000 g)。 6.5 涡旋振荡仪。 6.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.7 生物安全柜。 6.8 实时荧光PCR仪。 6.9 不同量程移液器:100 μL~1 000 μL、20 μL~200 μL、10 μL~100 μL、0.5 μL~10 μL。 6.10 离心管:2 mL、1.5 mL和0.2 mL。 6.11 八连PCR管、不同量程移液器的配套吸头。 7 材料与试剂 试剂在没有特殊说明的情况下为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。 7.1 萨氏培养液:按照A.1执行。 7.2 DNA提取液:按照A.2执行。 7.3 RNA酶(10 mg/mL)。 7.4 Taq DNA聚合酶。 2SN/T5514—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 7.5 dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。 7.6 10×PCR 缓冲液:200 mmol/L Tris-HCL(pH8.4),200 mmol/L kcl,15 mmol/L MgCl2。 7.7 阳性质控菌株:用产黄曲霉毒素菌株(如:黄曲霉标准菌株Aspergillus flavusCGMCC 3.440 8或 者寄生曲霉Aspergillus parasiticusCGMCC 3.12 4,或其他来源于正规保藏机构的合格菌株),单端孢 霉烯族毒素菌株(如禾谷镰刀菌标准菌株Fusarium graminearumCFCC 80357,或其他来源于正规保 藏机构的合格菌株),产玉米赤霉烯酮毒素菌株(如禾谷镰刀菌标准菌株Fusarium graminearumCFCC 80357,或其他来源于正规保藏机构的合格菌株)。 7.8 阴性质控菌株:用不产黄曲霉毒素、单端孢霉烯族毒素和玉米赤霉烯酮毒素菌株(如烟曲霉As- pergillus fumigatus CGMCC 3.5301,或其他来源于正规保藏机构的合格菌株)。 7.9 实验用引物探针序列及选用:对待检可疑菌,按照表1选用基因进行检测。基因的引物和探针按 照表2中序列合成,加超纯水配制成100 μmol/L储备液,实时荧光PCR 扩增的引物和探针工作液浓度 为10 μmol/L。食品中产毒素真菌特征基因扩增靶标参考序列参见附录B。 表1 产毒素真菌荧光PCR基因选用 可疑产毒素菌株 选择检测的基因 产黄曲霉毒素菌株 ITS,aflR,omt-1,ver-1 产单端孢霉烯族毒素菌株 ITS,Tri5 产玉米赤霉烯酮毒素菌株 ITS,PKS13 表2 产毒素真菌荧光PCR引物探针序列 基因引物/探针 名称引物/探针序列 5.8SrDNA-ITSITS-F 5’-CTCTTGGTTCCGGCATC-3’ ITS-R 5’-CGCAATGTGCGTTCAAAGA-3’ ITS-P 5’-FAM-TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA-BHQ1-3’ 调控基因 aflRaflR-F 5’-CGCCTCATGCTCATACCC-3’ aflR-R 5’-GAGACGCTACTGCTACCAT-3’ aflR-P 5’-FAM-AATCAACCACCACACGCTCT-BHQ1-3’ 柄曲霉素转 甲氧基酶 omt-1omt-1-F5’-CACCGAAGCCACGAAG-3’ omt-1-R5’- GCTGAGATGACCACGAC-3’ om