̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э I C S6 5.0 2 0.3 0 C C SB 4 1 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/T5 4 8 8—2 0 2 2 猪衣原体病检疫技术规范 Qu a r a n t i n e pr o t o c o l f o r s w i n e c h l a myd i o s i s 2 0 2 2-0 7-0 7发布 2 0 2 3-0 2-0 1实施 中华人民共和国海关总署 发 布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照 G B/T 1. 1—2 0 2 0《标准化工作导则 第1部分:标准化文件结构和起草规则 》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件起草单位 :中华人民共和国重庆海关 ,中华人民共和国哈尔滨海关 、中华人民共和国成都 海关。 本文件主要起草人 :王昱、史梅梅、谭策、杨俊、聂福平、李应国、余华、吴蕊、唐昌杰、谢小倩、张欢。 ⅠS N/T5 4 8 8—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 猪衣原体病检疫技术规范 1 范围 本文件规定了猪衣原体病的临床和病理学诊断 、病原分离和鉴定 (含细胞分离 、鸡胚分离 、染色观 察)和聚合酶链式反应的技术要求 。 本文件适用猪衣原体病的监测和检疫 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本 (包括所有的修改单 )适用于 本文件。 G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 G B/T 1 8 0 8 8 出入境动物检疫采样 G B 1 9 4 8 9 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 DMEM:杜尔贝科改良伊格尔培养基 (D u l b e c c o ’s Mo d i f i e d E agl e M e d i u m ) ; F AM: 蓝色羧基荧光素 (C a r b o xy- f l u o r e s c e i n ) ; F I T C:异硫氰酸荧光素 (F l u o r e s c e i n i s o t h i o cya n a t e) ; P C R:聚合酶链式反应 (P o lym e r a s e c h a i n r e a c t i o n ) ; S P F:无特定病原 (Spe c i f i c -pa t h oge n - f r e e) 。 5 临床诊断 5.1 临床症状及病理变化 5.1.1 临床症状 猪衣原体病特征症状包括初产母猪突发流产 、早产、产死胎或弱仔 ;适繁母猪群不育空怀 ;种公猪繁 育能力下降 ;仔猪腹泻 、跛行或肺炎症状 (见附录A) 。 5.1.2 病理变化 猪衣原体病特征病变包括流产胎儿全身皮肤出血 ,水肿,肝充血、出血和肿大 ,下颌淋巴结肿胀 ,间 1S N/T5 4 8 8—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 质性肺炎 ,关节滑膜炎和回肠末端淋巴结显著增生 ;种公猪尿道炎 、睾丸炎、副睾炎;仔猪肺炎 、肠炎、多 发性关节炎 、脑炎、浆膜炎和结膜炎 (见附录B) 。 5.2 结果判定 根据特征性临床症状和病理变化可以做出初步预判 。进一步确诊应采集样品进行实验室检测 。 6 样品的采集 6.1 安全要求 按照G B/T 1 8 0 8 8确定采样动物的数量 ;涉及到病原分离培养的应在生物安全二级实验室中进行 , 样品的保存和废弃物应按照 G B 1 9 4 8 9要求进行 。 6.2 拭子样品 用无菌棉拭子采集鼻腔 、眼眶、直肠或生殖道分泌物 ,放入1 mL采样缓冲液的无菌试管中 ,加冰袋 保鲜,于4 8 h内送到实验室 。 6.3 组织样品 无菌采集死亡病猪或流产胎儿肺脏 、扁桃体、心血、胸水、脑脊液、气管和关节积液等病料适量 。用 于病原分离的样品浸于足量的采样缓冲液中 ,加冰袋保鲜或低温冷冻 ,并于4 8 h内送到实验室 ;用于切 片的组织块应浸于足量的 B o u i n固定液中 ,2 4 h内送至实验室 。 6.4 精液 无菌采集 0. 5 mL以上的猪精液于离心管中 ,加冰袋保鲜 ,于4 8 h内送到实验室 。 7 病原分离和鉴定 7.1 细胞分离 7.1.1 试剂和材料 敏感细胞 (H e l l a 2 2 9细胞或M c C oy细胞) 、胎牛血清 (无衣原体抗体 ) 、DMEM 培养液、庆大霉素 、 放线菌酮 、链霉素、万古霉素 、两性霉素 B 、庆大霉素 、水(符合G B/T 6 6 8 2 中一级水的要求 ) 、细胞培养 瓶和细胞培养板 。常见试剂配制按附录 C执行。 7.1.2 仪器和设备 CO2培养箱、Ⅱ级生物安全柜 、细胞板离心机 (水平转子 ,3 0 0 0 r/m i n) 。 7.1.3 操作方法 将组织样品按 1∶1 0比例研磨于采样缓冲液中 (液体样品除外 ) ,室温下5 0 0 g离心2 0 m i n取上层 清液,用4 5 0 μm o l/L~8 0 0 μm o l/L滤器过滤后接种 。对于粪拭子等严重污染样品添加链霉素和万古 霉素(2 5 μg/mL~1 0 0 μg/mL) 、两性霉素 B和庆大霉素 (5 0 μg/mL)预处理(5 ℃,静置2 4 h) 。取适量 样品加入 H e l l a 2 2 9细胞(或M c C oy细胞)单层表面 ,室温2 5 0 0 g离心感作 6 0 m i n(3 7 ℃更佳) ,然后静 置于3 7 ℃ 5% CO2下2 h,移走接种液 ,加入含无胎牛血清的 DMEM 培养液(添加0. 5 μg/mL放线菌 酮和2 0 μg/mL庆大霉素 ) ,3 7 ℃ 5% CO2下培养5 d ~7 d。期间收集细胞培养物及其上清液用 P C R 2S N/T5 4 8 8—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э (见8. 4和8. 5)方法鉴定 ,或将培养物转种到无菌的载玻片上制备细胞爬片 ,然后进行染色 (见7. 3)观 察。为增加分离成功率可以对接种后 6 d的阴性细胞培养物盲传 2代~3代。 7.2 鸡胚分离 7.2.1 试剂和材料 6日龄~7日龄S P F鸡胚(要求母体无衣原体感染 ,血清抗体阴性 ) 、1 mL注射器、蛋托、照蛋器。 7.2.2 仪器和设备 CO2培养箱(3 7 ℃±1 ℃) 、Ⅱ级生物安全柜 。 7.2.3 操作方法 取0. 4 mL样品接种 S P F鸡胚卵黄囊 ,3 7 ℃±1 ℃孵化4 d~1 3 d,剔除7 2 h内死亡鸡胚 ,收集 4 d~1 0 d鸡胚卵黄囊进行染色观察 (见7. 3)或P C R鉴定(见第8章) ,并按上述方法继续传代 3代~ 4代。 7.3 染色观察 7.3.1 试剂 姬姆萨染色试剂盒 、B o u i n固定液、丙酮(分析纯) 、甲醇(分析纯) 、P B S缓冲液、鼠源抗衣原体脂多 糖抗体、F I T C标记山羊抗小鼠 IgG。 7.3.2 设备和器材 载玻片、盖玻片、普通光学显微镜 、组织切片机 、Ⅱ级生物安全柜 (A型或B型) 、荧光倒置显微镜 。 7.3.3 样品制备 适合于本法的样品类型包括组织触片 、组织切片 、细胞爬片或其他细胞单层培养物 。整个操作过程 应在Ⅱ级生物安全柜内进行 ,方法如下 : — — —组织触片 :将病变组织 (如绒毛膜 、子叶、胎衣等)或生殖道拭子直接涂抹到载玻片上 ,然后在室 温下干燥 1 5 m i n~2 0 m i n固定。 — — —组织切片 :将病变组织修整为厚度不超过 5 mm的标本块 ,浸入B o u i n固定液中固定 8 h~ 2 4 h,7 0%乙醇洗涤 2遍~3遍,然后用切片机制作切片 (厚度≤4 μm) ,室温下干燥 1 5 m i n~ 2 0 m i n固定于载玻片上 。 — — —细胞单层 :制备见7. 1. 3。 7.3.4 姬姆萨染色 用适量的乙醇冰乙酸 (3/1,体积比)固定触片 、切片或细胞单层 1 0 m i n~1 5 m i n,P B S洗涤2次~3 次,用姬姆萨染色液染色 1 5 m i n~3 0 m i n,然后用清水轻柔冲洗表面多余的染液 ,适当干燥后在油镜下 观察。阳性标本片在镜下可见胞浆内疏松排列的包涵体 ,包涵体内可见许多染成深蓝色或暗紫色的衣 原体颗粒 (见图B. 6。 ) 7.3.5 荧光抗体染色 用适量的冰甲醇丙酮 (1/1,体积比)固定触片 、切片或细胞单层 ,4 5 m i n后去掉固定液 。用P B S缓 冲液洗涤 2次,每次2 m i n;加入适量鼠源抗衣原体脂多糖抗体 ,3 7 ℃孵育4 5 m i n,同上述方法洗涤 4 3S N/T5 4 8 8—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 次;再加入适量 F I T C标记山羊抗小鼠 IgG,3 7 ℃孵育4 5 m i n,同上述方法洗涤 4次;5 0 ℃烘箱中避光 干燥1 0 m i n,置倒置