̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS11.220 CCSB52 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5487—2023 十足目虹彩病毒1感染检疫技术规范 Technical specification of quarantine for infection with decapod iridescent virus 1 2023-12-29发布 2024-07-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 十足目虹彩病毒1感染检疫技术规范 SN/T 5487—2023 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023) 编辑部:(010)65194242-7530 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张0.75 字数21千字 2024年1月第一版 2024年1月第一次印刷 印数 1—500 * 书号: 155175·897 定价16.00元̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院、深圳质标科技有限公司、 深圳技术大学、中华人民共和国武汉海关、中国水产科学研究院黄海水产研究所、中华人民共和国湛江 海关、广西壮族自治区水产科学研究院。 本文件主要起草人:贾鹏、温智清、吴江、刘荭、张娜、王津津、郑晓聪、刘莹、邱亮、陈孝宇、童桂香、 杨冰。 ⅠSN/T5487—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 十足目虹彩病毒1感染检疫技术规范 1 范围 本文件规定了十足目虹彩病毒1(DIV1)感染的临床症状,规定了DIV1的套式PCR检测方法、实 时荧光PCR检测方法和综合判定。 本文件适用于DIV1感染的检测和诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ATPase:磷酸腺苷酶(adenosine triphosphatase) CTAB 十六烷基三甲基溴化胺(cetyltrimethyl ammonium bromide) Ct 循环阈值(cycle threshold) DIV1 十足目虹彩病毒1(decapod iridescent virus 1) DNA 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) dNTPs 三磷酸脱氧核糖核苷酸(deoxynucleotide triphosphates) EB 溴化乙锭(ethidiumbromide) MCP 主要衣壳蛋白 (major capsid protein) PCR 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) 5 仪器和设备 5.1 冷冻离心机。 5.2 微量移液器。 5.3 PCR扩增仪。 5.4 实时荧光PCR仪。 1SN/T5487—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 5.5 水平电泳仪。 5.6 凝胶成像仪。 5.7 超净工作台。 5.8 二级生物安全柜。 6 试剂和材料 6.1 水:符合GB/T 6682中一级水的规格。 6.2 阳性对照:感染DIV1的甲壳类动物组织,由海关总署指定单位提供。 6.3 阴性对照:未感染DIV1的甲壳类动物组织。 6.4 空白对照:无DNA酶的水。 6.5 抽提缓冲液,按A.1配制。 6.6 无水乙醇,分析纯,使用前预冷至-20 ℃。 6.7 70%乙醇。 6.8 蛋白酶K(20 mg/mL)。 6.9 乙酸铵(10 mg/mL)。 6.10 Tris饱和酚(pH≥7.8),分析纯。 6.11 酚/三氯甲烷/异戊醇(25∶24∶1)。 6.12 三氯甲烷/异戊醇(24∶1)。 6.13 TE缓冲液,按A.2配制。 6.14 TBE电泳缓冲液,按A.3配制。 6.15 Taq酶:-20 ℃保存,避免反复冻融或温度剧烈变化。 6.16 dNTPs:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10 mmol/L,-20 ℃保存。 6.17 10×PCR扩增缓冲液,按A.4配制。 6.18 6×上样缓冲液,按A.5配制。 6.19 2×实时荧光PCR预混液,见A.6。 6.20 套式PCR引物,浓度10 μmol/L,序列如下: DIV1-F1:5’-GGGCGGGAGATGGTGTTAGAT-3’ DIV1-R1:5’-TCGTTTCGGTACGAAGATGTA-3’ 扩增DIV1 ATPase基因457 bp的片段。 DIV1-F2:5’-CGGGAAACGATTCGTATTGGG-3’ DIV1-R2:5’-TTGCTTGATCGGCATCCTTGA-3’ 扩增DIV1 ATPase基因129 bp的片段。 6.21 实时荧光PCR引物和探针,浓度10 μmol/L,序列如下: DIV1-142F:5’-AATCCATGCAAGGTTCCTCAGG-3’ DIV1-142R:5’-CAATCAACATGTCGCGGTGAAC-3’ DIV1-142P:5’-FAM-CCATACGTGCTCGCTCGGCTTCGG-TAMARA-3’ 扩增DIV1的MCP基因142 bp的片段。 7 采样 7.1 采样对象和数量 采样对象包括凡纳滨对虾Penaeus vannamei、罗氏沼虾Macrobrachium rosenbergii、日本沼虾M. 2SN/T5487—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э nipponense、脊尾白虾Exopalaemon carinicauda、克氏原螯虾Procambarus clarkii、红螯螯虾Cherax quadricarinatus、斑节对虾P.monodon、中国对虾P.chinensis、日本对虾P.japonicus和三疣梭子蟹 Portunus trituberculatus,应采集有临床症状的样品(参见附录B)。采样数量和样品运送及保存按照 GB/T 18088规定执行。 7.2 样品前处理 实验室取样检测时,仔虾采集除眼球和眼柄外的完整个体;幼虾至成虾阶段可采集鳃、肝胰腺、造血 组织、附肢或血淋巴;亲虾的非致死检测采集血淋巴、附肢或粪便。所取样品组织置于离心管中,立即进 行DNA提取或暂存于-20 ℃冰箱。实验室检测条件应符合GB 19489的规定。 8 诊断方法 8.1 套式PCR方法 8.1.1 设立对照 从提取DNA开始,每个步骤均需设立阳性对照、阴性对照、空白对照。 8.1.2 核酸提取 取30 mg~50 mg组织样品,加入抽提缓冲液500 μL,充分研磨,37 ℃孵浴1 h。加入20 mg/mL 蛋白酶K 2.5 μL至终浓度100 μg/mL,混匀后置于50 ℃水浴3 h,不时旋动。将溶液冷却至室温,加入 等体积Tris饱和酚,颠倒混合10 min,于10 000 r/min离心3 min。取上层水相移至新的离心管中,加 入等体积酚/三氯甲烷/异戊醇(25∶24∶1),颠倒混合10 min,于10 000 r/min离心1 min。取上层水 相移至新的离心管中,加入等体积三氯甲烷/异戊醇(24∶1),颠倒混合10 min,于10 000 r/min离心1 min。取上层水相移至新的离心管中,加入100 μL 10 mol/L乙酸铵,混匀后,再加入两倍体积预冷无水 乙醇(-20 ℃)混匀,-20 ℃放置2 h。10 000 r/min离心10 min,弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀2次, 每次10 000 r/min离心5 min,倾去上清,沉淀于室温干燥30 min。向DNA沉淀中加入50 μL TE缓 冲液,-20 ℃保存备用。 可使用同等效果的商品化核酸提取试剂盒代替以上方法。 8.1.3 第一步PCR反应 使用引物DIV1-F1和DIV1-R1配制PCR反应体系。在反应管中加入10×PCR 扩增缓冲液 5 μL, dNTPs(10 mmol/L)1 μL,上游引物(10 μmol/L)1 μL,下游引物(10 μmol/L)1 μL,Taq酶 (5 U/μL)1 μL,DNA模板2 μL,双蒸水补充总体积至25 μL。瞬时离心后置于PCR扩增仪。 PCR反应条件如下:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35个循 环;72 ℃再延伸2 min;4 ℃保存。 第一步反应结束后,可先将PCR产物进行电泳分析,若出现457 bp大小目的条带,可直接进行测 序分析,否则需进行第二步PCR反应。 8.1.4 第二步PCR反应 使用引物DIV1-F2和DIV1-R2配制PCR反