̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS65.020.30 CCS B41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5486—2022 塞内卡病毒病检疫技术规范 Quarantine protocol for infection with seneca virus 2022-07-07发布 2023-02-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 目 次 前言 Ⅱ ………………………………………………………………………………………………………… 1 范围 1 ……………………………………………………………………………………………………… 2 规范性引用文件 1 ………………………………………………………………………………………… 3 术语和定义、缩略语 1 ……………………………………………………………………………………… 3.1 术语和定义 1 ………………………………………………………………………………………… 3.2 缩略语 1 ……………………………………………………………………………………………… 4 试剂与材料 1 ……………………………………………………………………………………………… 5 设备 2 ……………………………………………………………………………………………………… 6 病毒分离与鉴定 3 ………………………………………………………………………………………… 6.1 样品采集和处理 3 …………………………………………………………………………………… 6.2 接种及观察 3 ………………………………………………………………………………………… 6.3 培养物鉴定 3 ………………………………………………………………………………………… 7 RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法 4 ……………………………………………………………… 7.1 样品采集 4 …………………………………………………………………………………………… 7.2 样品制备 4 …………………………………………………………………………………………… 7.3 RNA提取 4 …………………………………………………………………………………………… 7.4 RT-PCR检测 4 ……………………………………………………………………………………… 7.5 实时荧光RT-PCR检测 5 …………………………………………………………………………… 8 病毒中和试验 5 …………………………………………………………………………………………… 8.1 病毒繁殖 5 …………………………………………………………………………………………… 8.2 毒价测定 5 …………………………………………………………………………………………… 8.3 中和试验程序 5 ……………………………………………………………………………………… 8.4 试验成立条件 6 ……………………………………………………………………………………… 8.5 结果判定 6 …………………………………………………………………………………………… 9 间接ELISA 6 ……………………………………………………………………………………………… 9.1 样品采集制备 6 ……………………………………………………………………………………… 9.2 检测步骤 6 …………………………………………………………………………………………… 9.3 结果判定 7 …………………………………………………………………………………………… 10 综合判定 7 ………………………………………………………………………………………………… 附录A (规范性) 病毒分离用试剂的配制 8 ……………………………………………………………… 附录B (规范性) RT-PCR用试剂的配制 9 ……………………………………………………………… 附录C (资料性) PCR扩增产物参考序列 10 ……………………………………………………………… 附录D (资料性) 病毒半数细胞培养感染量(TCID50)的计算(Karber法) 11 ………………………… 附录E (规范性) ELISA用试剂的配制 12 ………………………………………………………………… ⅠSN/T5486—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国深圳海关、云南省武定县动物疫病预防控制中心、湖南普简生物 科技有限公司、深圳市检验检疫科学研究院、深圳技术大学、中华人民共和国上海海关。 本文件主要起草人:林彦星、花群俊、黄超华、史卫军、曹琛福、杨俊兴、贾鹏、张强、金业、吴江、 林永涛。 ⅡSN/T5486—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 塞内卡病毒病检疫技术规范 1 范围 本文件规定了塞内卡病毒分离鉴定、反转录聚合酶链式反应、实时荧光反转录聚合酶链式反应、病 毒中和试验和酶联免疫吸附试验的技术要求。 本文件适用于塞内卡病毒病的检疫和流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义、缩略语 3.1 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BSA:bovine serum albumin,牛血清白蛋白。 CPE:cytopathic Effect,细胞病变。 Ct值:cycle threshold,阈值。 DEPC:diethylpyrocarbonate,焦碳酸乙二酯。 EDTA:ethylene diaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸。 ELISA:enzyme-linked immunosorbent assay,酶联免疫吸附试验。 HRP:horseradish peroxidase,辣根过氧化物酶。 OD值:optical density,光密度值。 PBS:phosphate buffer baline,磷酸盐缓冲溶液。 RT-PCR:reverse transcription-polymerase chain reaction,反转录聚合酶链反应。 TCID50:50% tissue culture infective dose,半数细胞培养感染。 TMB:3, 3’, 5, 5’-tetramethy-benzidine,四甲基联苯胺。 4 试剂与材料 4.1 水:符合GB/T 6682 所规定的一级水。 1SN/T5486—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 4.2 75%乙醇。 4.3 pH 7.4、0.01 mol/L PBS:配制方法应符合附录A的规定。 4.4 双抗及双抗储存液:配制方法应符合附录A的规定。 4.5 细胞生长液、细胞维持液、细胞消化液:配制方法应符合附录A的规定。 4.6 胎牛血清。 4.7 猪肾传代细胞(PK-15)。 4.8 DEPC水应符合附录B的规定,推荐使用商品化DEPC处理的无RNA酶的水。 4.9 病毒裂解液TRIzol。 4.10 异丙醇:分析纯,使用前于-18 ℃预冷。 4.11 氯仿:分析纯。 4.12 70%乙醇:用DEPC水和无水乙醇配制,使用前于-18 ℃预冷。 4.13 RT-PCR试剂盒。 4.14 RT-PCR引物:10 μmol/L。根据塞内卡病毒VP1基因序列设计,扩增长度为372 bp。 ———上游引物F1:5'- ATCAGACCTTGAAGTCACGGTG -3' ———下游引物R1:5'- GCGTTCTTGTACCGAACGTAC -3' 4.15 50×TAE缓冲液、1.5%琼脂糖凝胶、10×电泳上样缓冲液:配制方法应符合附录B的规定。 4.16 DNA 分子量标准。 4.17 实时荧光RT-PCR试剂盒。 4.18 实时荧光RT-PCR引物和探针:10 μmol/L。根据塞内卡病毒3D基因序列设计,扩增长度为 74 bp。 ———上游引物F2:5'- CCAACAAGGGTTCCGTCTTC -3' ———下游引物R2:5'- TTGGACGAATTTGCGTTTTAGA -3' ———探针P:5'- FAM-CTCCGACTTCCTCTCTCTCCGATGCTGT-BHQ1-3' 4.19 塞内卡病毒衣壳蛋白重组抗原。 4.20 标准阳性血清、标准阴性血清、标准塞内卡病毒。 4.21 HRP标记的兔抗猪IgG。 4.22 包被液、洗涤液、封闭液、稀释液、底物显色液及终止液:配制方法应符合附录E的规定。 5 设备 5.1 采样用具:剪刀、镊子、注射器、1.5 mL 离心管、10 mL离心管、研钵。采样工具必须经121 ℃± 2 ℃、15 min高压灭菌并烘干。 5.2 二级生物安全柜、高速冷冻离心机(离心速度12 000 r/min以