以正式出版文本为准ICS65.020.30 CCS B41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5484—2022 罗非鱼湖病毒病检疫技术规范 Quarantine protocol for the Tilapia lake virus disease 2022-07-07发布 2023-02-01实施 中华人民共和国海关总署发布以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 罗非鱼湖病毒病检疫技术规范 SN/T 5484—2022 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023) 编辑部:(010)65194242-7530 网址 www.customskb.com/book 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张0.75 字数22千字 2023年1月第一版 2023年1月第一次印刷 印数 1—500 * 书号: 155175·898 定价12.00元以正式出版文本为准前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:深圳市检验检疫科学研究院、深圳海关动植物检验检疫技术中心、佛山科学技术 学院、茂名海关综合技术服务中心、深圳技术大学。 本文件主要起草人:刘荭、郑晓聪、刘辉、曾伟伟、温智清、朱崧琪、王津津、刘莹、贾鹏。 ⅠSN/T5484—2022以正式出版文本为准以正式出版文本为准罗非鱼湖病毒病检疫技术规范 1 范围 本文件规定了罗非鱼湖病毒的分离、实时荧光RT-PCR、套式RT-PCR的检测方法。 本文件适用于罗非鱼湖病毒病的监测、检测与检疫。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文本中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用 文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用 于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 3 术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件: BSA:Bovine serum albumin 牛血清白蛋白 Ct:Cycle threshold 循环阈值 CPE:Cytopathic effect 细胞病变效应 DEPC:Diethy pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯 dNTPs:Deoxynucleoside triphosphates 三磷酸脱氧核苷酸 RNA:Ribonucleic acid 脱氧核糖核酸 RT-PCR:Reverse transcription polymerase chain reaction 逆转录聚合酶链式反应 TiLV: Tilapia lake virus 罗非鱼湖病毒(参见附录A) 4 试剂和材料 4.1 水:符合GB/T 6682中二级水的规格。 4.2 DEPC水:配制方法见附录B.1或购买商品化试剂。 4.3 细胞培养液:见附录B.2。 4.4 细胞系:条纹鳢细胞系(E-11)。 4.5 HEPES:4-羟乙基哌嗪乙磺酸。 4.6 引物:用DEPC水将每条引物配制成100 μmol/L储存液,置于-20 ℃以下冻存;使用时,取适量 配制成20 μmol/L工作液,避免多次冻融。具体序列如下: a) 实时荧光RT-PCR引物与探针: TiLV-S3-F1:5’-CGAACTGTTGCCTTTGGAAATT-3’ TiLV-S3-R1:5’-TGAAGAATAAGTGGATTGCCTTTG-3’ TiLV-S3-P1:5’-FAM-CCGCGGCTGGCCTTCCAG-BHQ1-3’ 1SN/T5484—2022以正式出版文本为准 扩增TiLV-S3片段67bp。 b) 套式RT-PCR引物: TiLVF1:5’-TATGCAGTACTTTCCCTGCC-3’ TiLVF2:5’-TATCACGTGCGTACTCGTTCAGT-3’ TiLVR:5’-GTTGGGCACAAGGCATCCTA-3’ TiLVF1和TiLVR扩增TiLV S3片段415 bp片段;TiLVF2和TiLVR扩増TiLV S3片段 250 bp片段。 5 仪器和设备 5.1 倒置显微镜。 5.2 恒温培养箱。 5.3 荧光PCR仪。 5.4 PCR扩增仪。 5.5 凝胶成像仪。 6 临床症状 患病鱼主要症状为昏睡、游动异常、食欲不振、体色发黑、体表充血糜烂、腹部肿胀、眼球凸出、鳃丝 苍白等(参见附录A)。 7 病毒分离 7.1 采样 采样数量按照GB/T 18088的规定执行。体长≤4 cm的鱼苗取整条;体长4 cm~6 cm的鱼苗取 内脏(包括肾);体长>6 cm的鱼取肝、脑、肾和脾;成熟的雌鱼需取卵巢液;鱼卵直接使用。 7.2 样品处理 应保持在10 ℃以下进行处理。样品匀浆,用含有1 000 IU/mL青霉素和1 000μg/mL链霉素的细 胞培养液(见附录B.2)按1∶10稀释,混匀悬浮。于15 ℃下孵育2 h~4 h或4 ℃下孵育6 h~24 h。 7 000 r/min,4 ℃离心15 min, 收集上清液。卵巢液用细胞培养液稀释两倍以上,用相同的方法离心并 在以后的步骤中直接用其上清液。 7.3 病毒分离培养 将1∶10稀释的组织匀浆上清液用细胞培养液再做两次10倍稀释,然后将1∶10、1∶100、1∶ 1 000三个稀释度的上清液,用无菌操作方法,以适当的体积分别接种到生长约24 h的E-11细胞单层 中,每孔(2 cm2)的细胞单层最多接种100 μL。接种后的细胞板置于25 ℃±2 ℃培养7 d。接种的细胞 板需设2孔阳性对照(接种了TiLV的细胞)和2孔空白对照(未接种病毒的细胞)。 阳性对照组和待测样品都接种细胞后,7 d内每天用倒置显微镜检查。空白对照细胞应当正常,阳 性对照应出现CPE,CPE表现为局部区域细胞开始裂解,周围细胞收缩变圆,逐渐发展,细胞最终全部 脱落。如果接种样品的细胞在培养中出现CPE,立即进行鉴定。在培养7 d后如无CPE出现应进行再 传代培养。传代时,冻融并收集接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物,以7 000 r/min,4 ℃离 心15 min,收集上清液,将上清液接种到新鲜培养的E-11细胞单层,再培养7 d,每天用倒置显微镜 2SN/T5484—2022以正式出版文本为准检查。 如果阳性对照未出现CPE,则应换用一批E-11细胞和一批新的组织样品重新按上述方法进行病 毒分离。 7.4 结果判定 在空白对照细胞正常,阳性对照细胞出现CPE的情况下,样品接种细胞并盲传后均无CPE出现, 判为阴性;如果有CPE出现,应立即应用实时荧光RT-PCR、套式RT-PCR等方法进行鉴定。 8 实时荧光RT-PCR 8.1 设立对照 每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照可用DEPC水代替样品;阴性对照为 不含TiLV的组织或细胞培养物;阳性对照为含TiLV的阳性组织、细胞培养物或含目的片段的RNA。 8.2 RNA抽提 分别取200 μL待检样品组织上清液或待检样品细胞培养物,加入1 mL Trizol试剂,用移液器充 分吹打10次~20次,于室温下放置5 min;加入200 μL三氯甲烷,振荡混匀,于室温下放置15 min; 4 ℃12 000 r/min离心10 min;取上层水相至一新的离心管中,加等体积异丙醇,上下颠倒数次混匀,于 -20 ℃下放置20 min;4 ℃12 000 r/min 离心10 min;弃上清液,沉淀用1 mL 75%乙醇清洗;4 ℃ 8 000 r/min离心10 min,弃上清液,沉淀室温干燥5 min;加20 μL DEPC水溶解RNA 沉淀。4 ℃冰 箱保存备用,RNA溶液应避免反复冻融,并尽快用于检测。 RNA提取也可采用等效的商品化RNA提取试剂盒。 8.3 反应体系 在冰盒上配制25 μL反应体系。在PCR反应管中加入:DEPC水14 μL,10×一步法RT-PCR缓 冲液(不含Mg2+)2.5μL,dNTPs(各10 mmol/L)1 μL,MgCl2(25 mmol/L)2 μL,引物TiLV-S3-F1 (20 μmol/L)0.5μL,引物TiLV-S3-R1(20 μmol/L)0.5 μL,探针TiLV-S3-P1(20 μmol/L)0.5 μL, RNA酶抑制剂(40 U/μL)0.5 μL,AMV逆转录酶(5 U/μL)0.5 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL,样品RNA或对照2.5 μL,混匀。 可采用同等扩增效率的商品化荧光RT-PCR试剂盒。 8.4 反应条件 将已加样的PCR反应管短暂离心后放入荧光PCR仪,扩增反应条件设定:50