以正式出版文本为准ICS65.150 CCSB50 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5480—2022 虹鳟成分鉴定技术规范 实时荧光 PCR法 Technical specification for rainbow trout species identification—real-time PCR method 2022-07-07发布 2023-02-01实施 中华人民共和国海关总署发布以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、上海科技大学、厦门海关技术中心。 本文件主要起草人:蔡一村、王瑛、林颖峥、蒋静、徐淑菲、张强、王鑫杰、薛俊欣、王艳、潘良文、赵简。 ⅠSN/T5480—2022以正式出版文本为准以正式出版文本为准虹鳟成分鉴定技术规范 实时荧光 PCR法 1 范围 本文件规定了虹鳟物种成分实时荧光PCR检测方法。 本文件适用于水生动物及其产品中虹鳟物种成分定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 SN/T 5203 鱼类物种鉴定 基因条形码的检测技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 虹鳟 Oncorhynchus mykiss 又叫虹鲑、麦奇钩吻鲑,属于鲑科、太平洋鲑属。 3.2 吉尔大麻哈鱼 Oncorhynchus gilae 属于鲑科、太平洋鲑属。 3.3 线粒体DNA mitochondrial DNA,mtDNA 线粒体中的遗传物质,线粒体能为细胞产生能量,是在细胞线粒体内发现的脱氧核糖核酸特殊形, 与一般位于细胞核内的DNA有不同的演化起源,可能是源自早期细菌。 3.4 实时荧光PCR Real-time PCR 实时荧光定量PCR,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程。 Ct值cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 O.mykiss:虹鳟(oncorhynchus mykiss)。 DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid)。 dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)。 1SN/T5480—2022以正式出版文本为准bp:碱基对(basepair)。 real-time PCR:实时荧光定量PCR(real-time polymerase chainreaction)。 5 试剂与仪器 5.1 DNA提取试剂或DNA提取试剂盒(参见附录A)。 5.2 real-time PCR反应配套试剂。 5.3 蛋白酶K溶液,分析纯。 5.4 70%乙醇,分析纯。 5.5 TE缓冲液(Tris-Cl、EDTA缓冲液):10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),1 mmol/L EDTA(pH8.0)。 5.6 引物:用去离子水将每条引物探针配制成100 μmol/L储存液,置-20 ℃以下冻存;使用时取适量 配制成10 μmol/L工作液,避免多次冻融。序列见表1。特异性序列参见附录B。 表1 引物探针序列 名称 引物探针序列(5’—3’) O.mykiss-F AGTAATTATCGGCATACGAAACCAG O.mykiss-R GTTTCGATAATGATCAGTACTGGGATC O.mykiss-P FAM-CTACGGCCGCCCTCGGCCATTTAT-TAMRA 6 器材与设备 高速台式冷冻离心机、实时荧光PCR仪及相关配套设备、NanoDrop微量核酸蛋白测定仪、分析天 平、匀浆机、恒温振荡水浴设备、涡旋振荡仪、核酸分析仪、超净工作台、不同量程移液器、离心管等。 7 取样 7.1 取样对象 主要水生动物及其制品。 7.2 取样部位 宜取鲜活的组织,成鱼宜取但不限于肌肉组织(心、脑、脾、肾、肝、肠、胃等器官也适用),鱼卵取卵 膜。如需非致死性取样,剪取部分鳍条或者刮去部分皮肤后取皮下一小块3 mm3~5 mm3的肌肉块即 可。其他水生动物及其制品,例如罐头等,宜取肌肉组织部分,少有脂肪组织。 7.3 样品预处理 样本经过研磨后,称取200 mg固体样本或吸取200 μL液态样本于2 ml离心管中。每个样本取 3份,分别标记为检测样品、复检样品和保存样品,加封标记后冷冻保存备用。 2SN/T5480—2022以正式出版文本为准8 检测步骤 8.1 DNA提取 取20 mg剪碎样品组织或组织匀浆液置于1.5 mL离心管中,加入600 μL裂解液(见附录A)和 20 μL蛋白酶K溶液(见附录A),混匀,置56 ℃水浴1 h~3 h,其间每15 min轻微振动混匀;待消化完 全,冷却至室温,加入200 μL醋酸铵溶液(见附录A),混匀,4 ℃冷却5 min~10 min,使蛋白质析出;于 4 ℃,12 000 g离心10 min,上清液转移至另一1.5 mL离心管中,于4 ℃,12 000 g离心10 min,取上 清液至另一个洁净1.5 mL离心管中,加等体积异丙醇,轻轻摇匀,4 ℃放置15 min;4 ℃,12 000 g离心 10 min沉淀DNA;弃上清,加1 mL 75%乙醇,轻轻混匀,于4 ℃,12 000 r/min离心5 min,弃上清,晾 干;干燥后加入50 μL去离子水溶解;DNA提取液应置冰上备用,若需长期保存应置于≤-20 ℃保存。 也可采用经验证可靠的商业化DNA提取纯化方法或试剂盒进行核酸提取,具体参照说明书使用。 8.2 DNA浓度和纯度的测定 吸取DNA提取液1 μL,以去离子水作为空白对照,使用NanoDrop微量核酸蛋白测定仪测定 DNA模板的质量浓度及A260/A280比值。DNA的质量浓度根据以下公式计算:DNA的质量浓度= A260×50×稀释倍数(ng/μL)。当A260/A280比值在1.7~1.9之间时,适合于后续PCR扩增。 8.3 对照和平行设置 检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照、空白对照。 用含目标成分的样品或含目标片段的质粒作为阳性对照,以不含目标成分的样品或不含目标片段 的质粒作为阴性对照,以双蒸水为空白对照。样品和对照设置2个平行的反应体系。 8.4 反应体系 在0.2 mL PCR反应管中,按表2配制反应体系,加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳性对 照的次序分别加入模板,盖上管盖,充分混匀。 表2 real-time PCR实验反应体系 试剂a工作液浓度 体积 MasterMix 2× 12.5 μL O.mykiss-F 10 μM 1 μL O.mykiss-R 10 μM 1 μL O.mykiss-P 10 μM 0.5 μL DNA模板 — 5 μL 水 — 5 μL a最终反应体系中试剂添加的种类和总体系体积可能会根据不同的real-time PCR平台产生差异。进行不同re- al-time PCR平台的体系配置时,需要参照不同平台real-time PCR仪说明书,并且需要保证表1中所列组分的 终浓度不变。 8.5 反应程序 95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40个循环。 注: 根据不同real-time PCR仪器和配套试剂的要求,可以对反应程序中循环(扩增)步骤进行相应等效修改。 3SN/T5480—2022以正式出版文本为准9 质量控制 以下条件有任一不满足时,实验视为无效: 9.1 空白对照:荧光通道无荧光信号检出,Ct值≥40.0; 9.2 阴性对照:荧光通道无荧光信号检出,Ct值≥40.0; 9.3 阳性对照:荧光通道有荧光信号检出,且出现典型的扩增曲线,Ct值≤35.0。 10 结果判定 10.1 在符合第9章的情况下,检测结果按以下进行判定: 10.1.1 如Ct值≤35.0,则判定为检出虹鳟或吉尔大麻哈鱼成分; 10.1.2 如Ct值≥40.0,则判定为未检出虹鳟成分; 10.1.3 如35.0<Ct值<40.0,则重复一次。如再次扩增后Ct值仍<40.0,则判定为检出虹鳟或吉尔 大麻哈鱼成分;如再次扩增后Ct值≥40.0,则判定为未检出虹鳟成分。 10.2 如需要确定物种为虹鳟,可采用SN/T 5203进行确认。 4SN/T5480—2022