̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS65.020.30 B41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5479—2022 非洲猪瘟实验室快速检测方法 Laboratory rapid detection methods for African swine fever 2022-07-07发布 2023-02-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 目 次 前言 Ⅲ ………………………………………………………………………………………………………… 1 范围 1 ……………………………………………………………………………………………………… 2 规范性引用文件 1 ………………………………………………………………………………………… 3 术语和定义 1 ……………………………………………………………………………………………… 4 缩略语 1 …………………………………………………………………………………………………… 5 实验室生物安全基本要求 1 ……………………………………………………………………………… 6 双抗体夹心酶联免疫吸附试验 2 ………………………………………………………………………… 6.1 技术原理 2 …………………………………………………………………………………………… 6.2 试剂与设备 2 ………………………………………………………………………………………… 6.3 检测步骤 2 …………………………………………………………………………………………… 7 抗原检测胶体金免疫层析法 3 …………………………………………………………………………… 7.1 技术原理 3 …………………………………………………………………………………………… 7.2 试剂与材料 3 ………………………………………………………………………………………… 7.3 检测步骤 4 …………………………………………………………………………………………… 8 非洲猪瘟阻断酶联免疫吸附试验 4 ……………………………………………………………………… 8.1 技术原理 4 …………………………………………………………………………………………… 8.2 试剂与设备 5 ………………………………………………………………………………………… 8.3 检测步骤 5 …………………………………………………………………………………………… 9 非洲猪瘟间接酶联免疫吸附试验 6 ……………………………………………………………………… 9.1 技术原理 6 …………………………………………………………………………………………… 9.2 试剂与设备 6 ………………………………………………………………………………………… 9.3 检测步骤 6 …………………………………………………………………………………………… 10 抗体检测胶体金免疫层析法 7 …………………………………………………………………………… 10.1 技术原理 7 …………………………………………………………………………………………… 10.2 试剂与材料 7 ………………………………………………………………………………………… 10.3 检测步骤 8 …………………………………………………………………………………………… 11 重组酶聚合酶扩增试验 8 ………………………………………………………………………………… 11.1 技术原理 8 …………………………………………………………………………………………… 11.2 试剂与材料 8 ………………………………………………………………………………………… 11.3 设备与材料 9 ………………………………………………………………………………………… 11.4 检测步骤 9 …………………………………………………………………………………………… 附录A (规范性) ELISA用试剂的配制 11 ……………………………………………………………… ⅠSN/T5479—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国深圳海关、湖南普简生物科技有限公司、深圳市检验检疫科学研 究院、深圳技术大学、中华人民共和国上海海关。 本文件主要起草人:林彦星、花群义、吴江、黄超华、杨俊兴、史卫军、曹琛福、张强、曾少灵、金业、 贾鹏、李健、林永涛、阮周曦。 ⅢSN/T5479—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 非洲猪瘟实验室快速检测方法 1 范围 本文件规定了非洲猪瘟双抗体夹心酶联免疫吸附试验、抗原检测胶体金免疫层析法、阻断酶联免疫 吸附试验、间接酶联免疫吸附试验、抗体检测胶体金免疫层析法和重组酶聚合酶扩增试验的技术要求。 本文件适用于出入境检疫中非洲猪瘟流行病学调查、疫情监测和实验室快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 SN/T 5335 非洲猪瘟检测实验室生物安全操作技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ASFV:African swine fever virus,非洲猪瘟病毒; CTAB:cetyltrithylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵; DNA:deoxyribonuleic acid,脱氧核糖核酸; EDTA:ethylene diaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸; ELISA:enzyme-linked immunosorbent assay,酶联免疫吸附试验; HRP:horseradish peroxidase,辣根过氧化物酶; McAb:Monoclonal antibody,单克隆抗体; OD值:optical density,光密度值; PBS:phosphate buffer baline,磷酸盐缓冲溶液; PI值:percentage inhibition,阻断百分率; RPA:recombinase polymerase amplification,重组酶聚合酶扩增; Tris:tris (hydroxymethyl) aminomethane,三(羟甲基)氨基甲烷; T值:Time threshold,阈值时间。 5 实验室生物安全基本要求 进行非洲猪瘟实验室快速检测时,应按照GB 19489执行,并符合SN/T 5335中的规定。 1SN/T5479—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 6 双抗体夹心酶联免疫吸附试验 6.1 技术原理 非洲猪瘟双抗体夹心ELISA是在酶标板上包被ASFV VP72 McAb,形成固相抗体。然后加入待 检样品,如样品中含有特异性抗原,则与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物,通过洗涤去除其他未 结合物质,加入HRP标记的另一个ASFV VP72 McAb,形成一抗+抗原+酶标二抗固相免疫复合物, 加入底物后出现显色反应,来判定待检样品中的抗原含量。 6.2 试剂与设备 6.2.1 ASFV VP72 McAb:由指定单位提供。 6.2.2 HRP标记的ASFV VP72 McAb(针对VP72蛋白的不同表位):由指定单位提供。 6.2.3 ASFV阳性对照抗原、阴性对照抗原:由指定单位提供。 6.2.4 包被液、洗涤液、封闭液、稀释液、底物液及终止液:见附录A。 6.2.5 离心机、酶标仪、洗板机。 6.2.6 可拆96孔酶标板、一次性加样槽、单头微量可调移液器(10 μL,100 μL,1 000 μL )、8排微量可 调移液器(30 μL~300 μL)及配套吸头。 6.3 检测步骤 6.3.1 ASFV VP72 McAb包被 用包被液将ASFV VP72 McAb稀释至指定工作浓度,加入到酶标板中,每孔100 μL,4 ℃冰箱 过夜。 6.3.2 洗涤 取出酶标板甩去液体,并在洁净的吸水纸上轻拍干,每孔加入300 μL洗涤液,甩去孔内洗涤液,在 洁净的吸水纸上轻拍干,如此重复洗3次;也可用洗板机进行洗涤。 6.3.3 封闭 每孔加封闭液200 μL,37 ℃作用2 h;按照6.3.2所述方法进行洗涤。 6.3.4 待检样品处理 6.3.4.1 血清样品:取新鲜血液放于离心管中,静置,待血液凝固后,3 000 r/min离心5 min,所得上清 液即为血清,小心吸出上清液备用。 6.3.4.2 血浆样品:取新鲜血液加入到含抗凝剂的离心管中,颠倒混匀,3 000 r/min离心5 min,所得 的上清即为血浆,小心吸出上清液备用。 6.3.4.3 组织:取组织块约1 g,放入1.5 mL离心管中,加入200 μL稀释液,用研磨棒研磨,使用离心 机3 000