̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS65.020.30 CCSB41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5477—2022 布赫纳蝗螨检疫技术规范 Quarantine protocol for Locustacarus buchneri 2022-07-07发布 2023-02-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国福州海关、中华人民共和国太原海关、中华人民共和国潍坊海关、 中华人民共和国长春海关。 本文件主要起草人:张体银、黄嫦娇、巩红霞、郑腾、王武军、田国宁、宋战昀、常亚琦、张志灯、 于师宇。 ⅠSN/T5477—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 布赫纳蝗螨检疫技术规范 1 范围 本文件规定了布赫纳蝗螨的形态学、聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式反应检测方法。 本文件适用于熊蜂中布赫纳蝗螨的检测和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件: Ct 循环阈值(Cycle threshold) DNA 脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid) dNTP 三磷酸脱氧核苷酸(Deoxynucleoside triphosphate) EB 溴化乙锭(Ethidium bromide) ITS 内转录间隔区 (Internal transcribed space) PCR 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction) TBE 三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸(Trihydroxymethyl aminomethane-boric acid-ethylene diamine tetraacetic acid ) TE缓冲液Tris-EDTA缓冲液(Tris-EDTA buffer) 5 设备、材料和试剂 5.1 设备 5.1.1 解剖显微镜。 5.1.2 高压灭菌锅。 5.1.3 PCR仪。 5.1.4 荧光PCR仪。 5.1.5 高速冷冻离心机(转速12 000 r/min)。 1SN/T5477—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 5.1.6 微量移液器。 5.1.7 生物安全柜。 5.1.8 DNA相对分子质量标准品(100 bp~1 000 bp)。 5.1.9 水平电泳仪。 5.1.10 凝胶成像系统。 5.1.11 电子天平(感量0.01 g)。 5.1.12 冰箱(2 ℃~8 ℃和-20 ℃)。 5.2 试剂 5.2.1 水:符合GB/T 6682一级水的规格。 5.2.2 液氮。 5.2.3 乳酸。 5.2.4 无水乙醚。 5.2.5 无水乙醇。 5.2.6 0.01 mol/L磷酸盐(PBS)缓冲液,配制方法见附录A.1。 5.2.7 10% SDS溶液,配制方法见附录A.2。 5.2.8 蛋白酶K。 5.2.9 5 mol/L的NaCl溶液,配制方法见附录A.3。 5.2.10 CTAB/NaCl溶液,配制方法见附录A.4。 5.2.11 三氯甲烷/异戊醇混合液,配制方法见附录A.5。 5.2.12 酚/三氯甲烷/异戊醇混合液,配制方法见附录A.6。 5.2.13 异丙醇。 5.2.14 TE缓冲液。 5.2.15 10×PCR 缓冲液。 5.2.16 dNTPs(含dCTP、dGTP、dATP、dTTP)。 5.2.17 Taq DNA聚合酶。 5.2.18 琼脂糖。 5.2.19 0.5×TBE缓冲液(配制方法见附录A.7)。 5.2.20 上样缓冲液(配制方法见附录A.8)。 5.2.21 核酸凝胶染料。 5.2.22 DNA相对分子质量标准物Marker。 5.2.23 DNA纯化回收试剂盒。 5.3 PCR引物 上游引物Loc-F1:5'-AAC CAT TCT CTC AAT TCA CCT-3'; 下游引物Loc-R1:5'-TCG AAG AAG GAT GTG TTG AAG T-3'; 根据布赫纳蝗螨线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因序列设计,扩增长度约为228 bp,用双蒸水溶 解至10 μmol/L后,保存于-20 ℃备用。 5.4 实时荧光PCR引物和探针 上游引物Loc-F2:5'-GGA CCC AAT CCT ATT CCA GCA-3'; 下游引物Loc-R2:5'-TGT TGT GGA GAT GTG TGA TAC G-3'; TaqMan探针qPCR-P:FAM-TGA TTC TTC GGA CAC CCA GAG GTC T-TAMRA; 2SN/T5477—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 根据布赫纳蝗螨线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因序列设计,扩增长度约为103 bp,用双蒸水溶 解至10 μmol/L后,保存于-20 ℃备用。 5.5 质控物质 使用感染布赫纳蝗螨的熊蜂样品组织或含目的片段的DNA作为阳性对照;使用未感染布赫纳蝗 螨的健康熊蜂样品组织作为阴性对照;用水作为空白对照。 6 采样 6.1 采样比例 6.1.1 当蜂群数量≤10群时,所有蜂群均采样。 6.1.2 当数量在11群~100群时,以10群采样量为基础,每增加10群,采样量增加1群。 6.1.3 当蜂群数量为101群~200群时,按总群数的15%采样。 6.1.4 当蜂群数量>200群时,以200群采样量为基础,每增加20群,采样量增加1群。 6.2 采样方法 从每个选定蜂群中采取活力较弱的熊蜂30只,放入烧杯内盖好,记录群号。检验前先将活蜂用乙 醚处死或置于冰箱冷冻室内冷冻10 min。 7 形态学检测 7.1 样品处理 随机选取10只熊蜂,去除翅和足。将样品放入50 mL量杯中,加入20 mL水,10 000 r/min匀浆3 次,每次30 s,制成悬液,经0.8 mm滤膜过滤,用水悬浮至20 mL,滤液经2 000 r/min离心5 min,弃去 上清,在沉淀物中加入100 μL乳酸,静置10 min,用解剖显微镜观察。 7.2 镜检 将处理好的样品进行解剖显微镜观察,根据布赫纳蝗螨若螨、成螨等各个时期的形态进行鉴别 (基 本信息及形态参见附录B和附录C)。 7.3 结果判定 根据镜检观察到的形态特征的符合程度可初步判定为阴性或疑似阳性,再进一步进行PCR或荧光 PCR试验。 8 PCR检测 8.1 设立对照 从提取DNA开始,每个步骤均需设立阳性对照、阴性对照、空白对照。实验室检测条件应符合 GB 19489实验室生物安全通用要求中二级生物安全防护要求。 8.2 DNA的提取 8.2.1 每群选取3只~5只处死后的熊蜂或死后新鲜的熊蜂,用灭菌的剪刀剪取腹部组织,转入 3SN/T5477—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 2.0 mL研磨管中,置于样品制备仪进行研磨处理,也可直接选取可疑虫体及其宿主熊蜂进行研磨 处理。 8.2.2 取研磨后的样本约25 mg转移至另一1.5 mL离心管中,加入50 μL TE缓冲液,使样品充分悬 浮后,加入60 μL10% SDS溶液和10 μL 20 mg/mL的蛋白酶K,混匀后于37 ℃下温育1 h。 8.2.3 加入100 μL 5 mol/L的NaCl溶液,上下颠倒充分混匀,加入80 μL CTAB/NaCl溶液,混匀后 65 ℃温育10 min;加入700 μL氯仿/异戊醇(体积比为24∶1),混匀后12 000 r/min离心5 min。 8.2.4 吸取上清至另一干净离心管,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(三者体积比为25∶24∶1),上下 颠倒混匀,12 000 r/min 离心5 min。 8.2.5 吸取上清至另一干净离心管,加入2倍体积预冷的异丙醇沉淀DNA,轻轻混匀,4 ℃下12 000 r/ min离心15 min,彻底去除上清。 8.2.6 用600 μL 70%预冷的乙醇洗涤沉淀,4 ℃下12 000 r/min离心10 min,弃上清,再瞬时离心,用 移液器彻底吸除酒精,在超净工作台上自然晾干。 8.2.7 加入20 μL TE缓冲液溶解DNA,-20 ℃下保存。 8.2.8 DNA提取也可选用等效的商品化试剂盒。 8.3 PCR扩增 8.3.1 反应体系 普通PCR反应体系见表1。PCR扩增可以采用等效的商品化DNA扩增试剂盒。 表1 普通PCR反应体系 名称 工作浓度 终浓度 加样量 10×PCR缓冲液 10× 1× 2.5 μL dNTPs 10 mmol/L 0.2 mmol/L 0.5 μL Taq DNA聚合酶 5 U/μL 0.1 U/μL 0.5 μL 上游引物Loc-F1 10 μmol/L 0.4 μmol/L 1