ICS 11.220 CCS B 41 SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5474—2022 非人源样本中新型冠状病毒（ SARS-CoV-2) 的检测技术规范 Protocol for detection of novel coronavirus (SARS -CoV -2)in non human source samples 2022 - 03 -14发布 2022 - 10 - 01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T 5474—2022 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 －2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的 规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位： 中华人民共和国武汉海关、 中华人民共和国上海海关、 中华人民共和国成都海关、 中华人民共和国南京海关、上海速芯生物科技有限公司、宁波爱基因科技有限公司。 本文件主要起草人：陈孝宇、薛俊欣、郑剑、方雪恩、林华、姜焱、陈建军、陈鑫、周旋、卢先东、 孔继烈、刘艳红、张强、申进玲、李季。 SN/T 5474—2022 1 非人源样本中新型冠状病毒（ SARS-CoV-2）的检测技术规范 1 范围 本文件规定了动物、物品、环境和水体等非人源样本的采集，以及样本中新型冠状病毒核酸的检测 方法，包括实时荧光 RT-PCR法和 RT-RPA法，以及 RT-LAMP微流控芯片现场快速检测方法。 本文件适用于非人源样本的新型冠状病毒核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文本中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用 于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 卫办医政发〔 2010〕 194号 医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法 国卫办科教函〔 2020〕70号 新型冠状病毒实验室生物安全指南 联防联控机制医疗发〔 2020〕271号 医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册 3 术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 非人源样本 源自动物 、物品、环境和水 体等采集的样本。 3.1.2 重组酶聚合酶扩增技术 recombinase polymerase amplification ，RPA 重组酶聚合酶扩增技术是一种通过重组酶介导链置换， 可对模板上靶序列区域进行指数扩增的 等温 核酸扩增技术。 3.1.3 环介导等温扩增技术 loop-mediated isothermal amplification ，LAMP 环介导等温扩增技术是一种依赖于识别靶序列的特异性片段的引物和链置换 DNA聚合酶的等温核 酸扩增技术。 3.1.4 微流控 microfluidics 微流控是使用微管道 (尺寸为数十到数百微米 )处理或操纵微小流体的系统所涉及的科学和技术，是 涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工 程的新兴交叉学科。 3.1.5 SN/T 5474—2022 2 微流控芯片技术 microfluidic chip technology 把生物、化学、医学分析过程中的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺 寸的芯片上，自动完成分析全过程的技术。 3.1.6 Ct值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 3.1.7 Tt值 time threshold 每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所需要的时间。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid ）。 RNA：核糖核酸（ ribonucleic acid ）。 RNase：核糖核酸酶 （ribonuclease ）。 PEG：聚乙二醇 （polyethylene glycol ）。 PBS：磷酸缓冲盐溶液 （phosphate buffered saline ）。 4 原理 针对新型冠状病毒（ SARS -CoV-2）保守基因序列 设计引物及探针，采用 实时荧光 RT-PCR、RT-RPA 和RT-LAMP等方法进行反转录与扩增。若样本中含有目的片段而得到扩增，可产生 荧光信号被检测器 实时捕获， 通过荧光信号 的产生来判断样本中是否含有 SARS -CoV-2核酸。 恒等温核酸检测方法与微流控芯片法的联合使用， 将引物固定在微流控芯片相应位置后对微流控芯 片进行封装。将提取的核酸模板与反应液混合后，加入封装好的微流控芯片中，放入带有离心和恒温功 能及实时荧光检测一体化的微流控芯片检测仪中， 利用离心力驱动样品进入微流控芯片反应孔中进行恒 温扩增。若样本中含有目的基因片段而得到扩增，根据其产生荧光信号的时间、强度和位置，判断样本 中是否含有 SARS -CoV -2核酸。 5 生物安全要求 5.1 实验室设备、设施 及废弃物处理等 要求 应符合 GB 19489 的规定。 5.2 实验室管理和人员要求 5.2.1实验室管理要求 开展核酸检测的实验室，应当符合《病原微生物实验室生物安全管理条例》 （国务院令第 424号） 和《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》有关规定，具备经过卫生健康行政部门审核备案的生 物安全二级及以上实验室条件，以及临床基因扩增检验实验室条件。 新型冠状病毒样本运输和实验室检测流程 应符合《新型冠状病毒实验室生物安全指南》和《医疗机 构新型冠状病毒核酸检测工作手册》的相关要求。 5.2.2样本采集人员要求 SN/T 5474—2022 3 样本采集人员应当经过生物安全培训并合格，熟悉样本采集方法，熟练掌握样本采集操作流程。应 严格按照操作流程进行采样，按要求做好标本信息记录，确保标本质量符合要求、标本及相关信息可追 溯。 采样人员防护装备要求： N95及以上防护口罩、护目镜、防护服、乳胶手套、防水靴套；如果接触 血液、体液、分泌物或排泄物，戴双层乳胶手套；手套被污染时，及时更换外层乳胶手套。每采一个样 本应当进行严格手消毒或更换手套。 5.2.3样本检测人员要求 实验室检测技术人员应当具备实验室工作经历以及相关专业技术技能， 接受过新冠病毒相关检验检 测技能培训。检测机构应当按照所开展检测项目及标本量配备实验室检测人员，以保证及时、高效完成 检测和结果报告。检测人员应采用生物安全三级实验室的个人防护。 6 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均 用无 RNase污染的容器分装。 相关溶液配制参照附录 A。 6.1 40 mL甘氨酸缓冲液。 6.2 5×PEG/NaCl 溶液。 6.3 磷酸盐缓冲液 (PBS)。 6.4 Trizol。 6.5 三氯甲烷。 6.6 异丙醇。 6.7 75%乙醇。 6.8 磁珠法提取试剂。 6.9 硫代硫酸钠。 6.10 实时荧光 RT-PCR ORF1ab基因引物和探针： 上游引物 OF：5-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA -3’； 下游引物 OR：5’-ACGATTGTGCATCAGCTGA -3’； 探针 OP：FAM -CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG -BHQ1。 N基因引物和探针： 上游引物 NF：5’-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT -3’； 下游引物 NR：5’-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG -3’； 探针 NP：FAM -TTGCTGCTGCTTGACAGATT -BHQ1。 6.11 实时荧光 RT-RPA ORF1ab基因引物和探针： 上游引物 ROF：5’-TGGTGCATCGTGTTGTCTGTACTGCCGTTGCCA -3’； 下游引物 ROR：5’-CTACAGCCATAACCTTTCCACATACCGCAGACG -3’； 探针 ROP：TGTGACTTAAAAGGTAAGTATGTACAAA[FAM -dT]A[THF]C[BHQ1 -dT] ACAACTTGTGCTA -C3 spacer 。 6.12 实时荧光 RT-LAMP ORF1ab基因引物： 外侧上游引物 OF3：5’-GAGCCATGCCTAAYATGC -3’； SN/T 5474—2022 4 外侧下游引物 OB3：5’-CTCCTGATGAGGTTCCAC -3’; 内侧上游引物 OFIP：5’-CGGTGTGACAAGCTACAACACGAATTATGGCCTCACTTGTTC -3’； 内侧下游引物 OBIP：5’-GATTAGCTAATGAGTGTGCTCAAGTTTTAACATATAGTGAACCGCC -3’。 N基因引物：