̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э I C S6 5.0 2 0.0 1 C C SB1 6 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/T5 4 7 1—2 0 2 2 西红花鉴定方法 I d e n t i f i c a t i o n o f C r o c u s s a t i v u s L. 2 0 2 2-0 7-0 7发布 2 0 2 3-0 2-0 1实施 中华人民共和国海关总署 发 布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照 G B/T 1. 1—2 0 2 0《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 :拱北海关技术中心 、海关总署国际检验检疫标准与技术法规研究中心 。 本文件主要起 草人 :张卫东、孙双艳、黄静、林伟、闫 邦 奇、权 永 兵、徐 淼 锋、廖 力、水 克 娟、 黄永辉、迟远丽。 ⅠS N/T5 4 7 1—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 西红花鉴定方法 1 范围 本文件描述了中药材西红花的形态学和 DNA条形码检验鉴定方法 。 本文件适用于西红花与常见伪品的真伪鉴定 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本 (包括所有的修改单 )适用于 本文件。 G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 G B/T 1 9 4 9 5. 2 转基因产品检测 实验室技术要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 花柱 s tyl e 柱头和子房间的连接部分 ,也是花粉管进入子房的通道 。 3.2 柱头 s t igm a 位于雌蕊的顶端 ,是接受花粉的部位 ,柱头成熟时为花粉萌发提供必要的物质与识别信号 ,一般膨 大或扩展成各种形状 。 3.3 雌雄同花 m o n o e c i o u s 雌蕊和雄蕊在同一朵花内的现象 。 4 基本信息 中文名:西红花 学名:C r o c u s s a t i v u s L. 异名:C.a u t u m n a l i s S m i t h;C.of fi c i n a l i s (L.) H o n c k.;C.of fi c i n a l i s v a r .s a t i v u s Hu d s;C.o r s - i n i i P a r l;C.pe n d u l u s S t o k e s;C.s a t i v u s v a r .c a s b m i r u a n u s R oyl e;C.s a t i v u s s u b sp.o r s i n i i(P a r l .) K. R i c h t .;C.s a t i v u s v a r .of fi c i n a l i s L.;C.s a t i v u s v a r . o r s i n i i (P a r l .) M a w;C.s e t ifo l i u s S t o k e s; G e a n t h u s a u t umn a l i s R a f .;S afr a n of fi c i n a r u m M e d i k. 分类地位 :被子植物门 A ngi o spe r m a e,单子叶植物纲 Mo n o c o t yl e d o n e a e ,百合目 L i l i f l o r a e ,鸢尾科 I r i d a c e a e ,番红花属 C r o c u s L.。 西红花(C r o c u s s a t i v u s L.)是鸢尾科植物番红花 (参见附录 A)的干燥柱头 ,具有很强的活血化瘀 、 1S N/T5 4 7 1—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 凉血解毒和解郁安神的功效 。市场上常见的伪品有红花 (C a r t h a m u s t i n c t o r i u s L.)管状花冠 、菊花 (C h rys a n t h e m u m ×m o r ifo l i u m R a m a t .)舌状花冠 、莲(N e l u m b o n u c ife r a G a e r t n. )的干燥雄蕊 、玉米 (Z e a mays L.)花柱染色制品等 。 5 方法原理 根据番红花属的内转录间隔区 (i n t e r n a l t r a n s c r i b e d spa c e r 2,I T S 2)序列特征 ,应用DNA条形码 技术对西红花进行初筛鉴定 ,观察西红花的形态特征进行种类鉴定 。 6 主要仪器设备 、用具和试剂 6.1 主要仪器设备 P C R仪、电泳仪、凝胶成像分析系统 、体视显微镜 、生物显微镜 、分析天平 (感量0. 1 mg) 、低温冷冻 高速离心机 、微量分光光度仪 、组织研磨器 、生物安全柜 、冰箱。 6.2 主要用具 移液器(1 0 0 0 μL、2 0 0 μL、1 0 0 μL、1 0 μL、2. 5 μL)及配套枪头 、离心管、放大镜、研钵、镊子等。 6.3 主要试剂 十六烷基三甲基溴化胺 (C TA B) 、T r i s饱和酚、三氯甲烷 、异戊醇、异丙醇、7 5%乙醇、9 5%乙醇、蛋 白酶K (2 0 mm o l/μL) 、RN a s e A、液氮、T E缓冲液、1 0×P C R 缓冲液、氯化镁(2 5 mm o l/L) 、d NT P (1 0 mm o l/L) 、T aq酶(5 U/μL) 、引物、琼脂糖、DNA分子量标记和电泳缓冲液 。 除另有规定外 ,所有试剂均为分析纯 ,试验用水应符合 G B/T 6 6 8 2中相关规定 。 7 鉴定方法 7.1 形态学鉴定 通过肉眼 、放大镜和体视显微镜观察西红花的形态特征 ,依据西红花形态特征 (参见附录 B)进行种 类鉴定。 7.2 分子生物学检测 7.2.1 D N A提取 西红花DNA提取方法按附录 C执行。 7.2.2 P C R检测 西红花P C R检测应设置空白核酸提取对照和空白扩增对照 ,每个样品设置两个平行反应 ,具体方 式按照G B/T 1 9 4 9 5. 2 中相关规定进行 。 具体操作按附录 D执行,西红花与常见伪品 I T S 2序列信息参见附录 E。 2S N/T5 4 7 1—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 8 鉴定特征 8.1 性状鉴别特征 本品为鸢尾科植物番红花的干燥柱头 ,松散线状 ,三分枝,长约3 c m,表面暗红色 ,上部较宽而略扁 平,顶端边缘显不整齐的齿状 ,内侧有一短裂隙 ,下端有时残留一小段黄色花柱 。体轻,质松软,无油润 光泽,干燥后质脆易断 。气特异,微有刺激性 ,味微苦。将柱头投入水中则膨胀 ,可见橙黄色成直线下 降,并逐渐扩散 ,水被染成黄色 。无沉淀,柱头呈喇叭状 ,有短缝。在短时间内用针拨之不破碎 。 8.2 显微鉴别特征 显微镜下柱头碎片由长方形薄壁细胞组成 ,排列紧密 ,内含色素物质 。柱头上缘的薄壁细胞呈长条 形,密集成绒毛状 ,长至1 0 0 μm。外表皮细胞壁突起呈乳头状 。花柱碎片为长方形薄壁细胞 ,排列紧 密。细胞中含有小型草酸钙方晶或簇晶 。导管多为环纹 ,细小,直径7. 5 μm~1 5 μm ,存在于花柱或柱 头组织碎片内 ,亦可见螺纹导管 。花粉粒呈圆球形 ,直径约1 0 0 μm ,外壁近于光滑 ,内含颗粒状物质 。 萌发孔难察见 。 8.3 西红花与常见伪品的区别 西红花与常见伪品的区别参见附录 B。 9 结果判定 9.1 形态学结果判定 送检样品符合第 8章所描述的形态鉴定特征的 ,判定为西红花 。 9.2 分子生物学结果判定 送检样品 I T S 2基因序列结果与西红花基因序列相似性最高 ,最大相似度在 9 9% 以上,且形态学 特征符合第 8章描述的形态鉴定特征的 ,判定为西红花 。 送检样品 I T S 2基因序列结果与西红花基因序列相似性低于 9 9%,判定为非西红花 。 1 0 样品保存和处理 样品应在低温的条件下保存 ,保存期为 1年,以备复验 。保存期满后 ,样品经灭活后妥善处理 。 3S N/T5 4 7 1—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 附 录 A (资料性) 番红花的形态鉴定特征 A.1 基本生物学特性 多年生草本 。 A.2 植株形态特征 A.2.1 茎 鳞茎扁圆球形 ,直径约3 c m,外被褐色膜质鳞叶 。 A.2.2 叶 叶均基生 ,9枚~1 5枚,窄条形,长1 5 c m~2 0 c m,宽2 mm~3 mm,边缘反卷 ,生细毛,基部有 4片~5片宽卵形 、鞘状鳞片 。 A.2.3 花 花茎甚短 ,不伸出地面 ;花1朵~2朵,顶生呈半开状 ,雌雄同花 ,淡蓝色、红紫色或白色 ,有香味,直 径2. 5 c m~3 c m;花被裂片 6,2轮排列,倒卵形,淡紫色,花被筒细管状 ,长4 c m~6 c m;雄蕊3枚,直 立,长2. 5 c m,花药黄色 ,