̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS65.020.20 CCSB16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5467—2022 梨波氏盘菌果腐病菌检疫鉴定方法 Identification of Potebniamyces pyri (Berk.& Broome)Dennis 2022-07-07发布 2023-02-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国大连海关、吉林省林业科学研究院、中华人民共和国沈阳海关、沈 阳农业大学。 本文件主要起草人:李鑫、李立梅、罗佳、徐君怡、王秀芬、付海滨、吴元华、张寅寅、黑多尔。 ⅠSN/T5467—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 梨波氏盘菌果腐病菌检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了梨波氏盘菌果腐病菌的检疫鉴定方法。 本文件适用于进境鲜梨、苹果及相关寄主植物产品携带的梨波氏盘菌果腐病菌的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 基本信息 中文名:梨波氏盘菌果腐病菌 英文名:Phaciodiopycnis rot of pear 学名:Potebniamyces pyri(Berk.& Broome)Dennis 无性态:Phacidiopycnis piri 分类地位:Potebniamyces pyri,属于子囊菌门(Ascomycota),盘菌纲(Discomycetes),星裂盘菌目 (Pezizales),星裂盘菌科(Phacidiaceae),波氏盘菌属(Potebniamyces)。 无形态分类地位属于半知菌亚门(Deuteromyctina),腔孢纲(Coelomycetes),球壳孢目(Sphaero- sidales),球壳孢科(Sphaeropsidaceae),星裂壳孢属(Phacidiopycnis)。 梨波氏盘菌果腐病菌的其他信息参见附录A。培养性状及病菌形态参见附录B。 5 方法原理 病菌的症状、形态学特征及物种特异性基因序列作为鉴定依据。 6 仪器设备和主要试剂 6.1 仪器设备 电子天平(感量1/10 000 g)、解剖镜、显微镜、超净工作台、温控培养箱(0 ℃~100 ℃,±0.3 ℃)、 高压灭菌锅、低温冰箱、普通冰箱、移液器、水平凝胶电泳装置、PCR仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心 机等。 1SN/T5467—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 6.2 主要试剂 Taq DNA聚合酶、DL2000 Marker、dNTP、10×PCR缓冲液、无水乙醇等。 试验用水应符合GB/T 6682的要求。 7 检疫鉴定方法 7.1 症状观察 枝条症状检查:观察嫩枝顶梢是否枯死,树皮是否干枯,枝干上是否溃疡或坏死,病部是否有细小的 黑色颗粒状分生孢子器等病症。 果实症状检查:仔细检查果蒂、果萼及果实表面是否有腐烂病斑、菌丝、分生孢子器等。 将可疑样品带回实验室作进一步检验,记录样品品种、数量、来源地及取样地点、取样人和取样日期 等信息。 7.2 直接镜检 若疑似样品病斑部位有菌丝或分生孢子器,用常用工具(如移植钩、移植环等)移于载玻片中央的水 滴中,在显微镜下观察,拍照记录。 7.3 病菌的分离、纯化及形态观察 若为枝条样品,剪切成采用4 mm×4 mm小块,75%乙醇浸泡消毒30 s,2%次氯酸钠消毒4 min, 无菌水冲洗3遍;若为果实样品,采用进行75%乙醇表面擦拭消毒,快速过火,切开去表皮,在病健交界 处取样,切成4 mm×4 mm小块。置于PDA平板上,每皿放置3块~4块;或在无菌状态下直接挑取 菌丝置于PDA培养基上,20 ℃~22 ℃黑暗条件下培养7 d~9 d,进行菌落形态观察。得到纯菌落后, 可用打孔器打取菌饼转移至梨块水琼脂养基中(培养基非梨块位置即可),20 ℃条件下20 d后进行分 生孢子器观察。 也可采用燕麦培养基(OMA),在20 ℃在黑暗和荧光交替的12 h周期下孵育。培养基配制按照附 录C执行。 7.4 致病性测定(可选) 选取纯培养菌落,用打孔器打菌饼,备用;选取健康苹果或梨,采用含75%乙醇的灭菌脱脂棉对果 实表面进行消毒,待表面蒸干后,用灭菌手术刀在果实表面切5 mm×2 mm的小口,将上述菌饼埋入其 中,用灭菌水浸湿脱脂棉敷于切口表面,设置一个空白对照(不接菌饼),装入自封袋放入20 ℃培养箱中 黑暗培养,10 d后每天观察一次。 致病性测定仅在首次检出时进行,常规检出可不进行致病性测定。 7.5 PCR检测 将纯化菌落采用CTAB法或商品化试剂盒提取总DNA(参见附录D),利用引物ITS 1/ITS 4或 Bt-LEV-Up4/Bt-LEV-Lo1进行PCR扩增后,均需送生物公司测序,进入GenBank进行序列比对。 8 鉴定特征 8.1 症状 P.pyri侵染梨果时可表现出3种症状:蒂腐、萼腐及与伤口有关的腐烂,分别由果蒂、果萼及果表 2SN/T5467—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 的伤口侵入。发病部位呈软腐状。显症初期,腐烂的部位呈水浸状。随着病害的发展,病部颜色逐渐加 深,先变成褐色后逐渐变成黑色,边缘仍呈水浸状。在相对湿度较高的条件下,病部易产生白色的菌丝, 且以侵染点为中心,在最初发病的部位形成分生孢子器。储藏期果实上的分生孢子器通常都是未发育 成熟的,仅能形成小型分生孢子。(参见附录A) 8.2 形态特征 在PDA平板上,20 ℃光照黑暗交替培养7 d,菌落直径(69.7±0.5)mm,菌丝初期为白色,后期为 灰褐色,散生。在梨块水琼脂培养基上培养20 d可初见大量分生孢子。在OMA培养基上,4周后可见 孢子产生,8周~12周孢子量较大,且可见大分生孢子。 分生孢子器聚生、埋生,球状,多腔室,直径500 μm~1 000 μm,褐色。产孢细胞瓶梗状,在腔室内 排列紧密,近圆柱形或烧瓶形,直立或不规则弯曲,透明,(5 μm~12.5 μm)×(2.5 μm~3.5 μm)。该 菌可产生大型分生孢子和小型分生孢子。 大型分生孢子透明至淡黄色,亚球形至球形,具油滴,大小为(6 μm~15 μm)×(5 μm~10 μm);小 型分生孢子在病菌的生活史中被认为是性孢子,单细胞,光滑,透明,椭圆形至泪状平端,大小(4 μm~ 6 μm)×(2 μm~2.5 μm)。分生孢子萌发有两种方式,直接产生芽管或是萌发产生次级分生孢子。 (参见附录B) 菌丝能在-3 ℃~25 ℃的温度下生长,30 ℃以上则不能生长,菌丝生长最适温度为20 ℃~25 ℃。 8.3 致病性测定 接种的果实产生8.1中描述的症状。 8.4 PCR检测 采用引物ITS 1/ITS 4可扩增出约550 bp的特异性条带,Bt-LEV-Up4/Bt-LEV-Lo1扩增后可得 到664 bp的条带,将条带回收测序,进行Blast比对,应与Potebniamyces pyri的序列同源性达99%以 上(ITS引物扩增后比对的同源序列包括EU 156042、EU 156043和EU 156044等;Bt基因扩增后比对 的同源序列包括EU 156056、EU 156055和EU 156054等)。具体步骤按照附录E执行。 9 结果判定 当样品有明显的病状和病症时,符合8.1、8.2、8.3及8.4特性,判定检出梨波氏盘菌果腐病菌,否 则判定未检出梨波氏盘菌果腐病菌。 当样品有病状但无典型病症时,经分离培养及分子生物学鉴定符合8.2、8.3及8.4特性,判定检出 梨波氏盘菌果腐病菌,否则判定未检出梨波氏盘菌果腐病菌。 10 样品与菌株的保存 10.1 菌种保存 制作PDA斜面培养基,把纯化的菌落接种到斜面培养基上,置于冰箱中4 ℃保存,备用。 10.2 样品保存 保存样品应按品种分别存放,经登记和经手人签字后置冰箱冷藏保存。同时保留电子图片,以备复 验、谈判和仲裁。保存期满后,灭菌处理。 3SN/T5467—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 附 录 A (资料性) 梨波氏盘菌果腐病菌的其他信息 A.1 寄主范围 苹果(Ma l u s) 、塞威氏苹果 [Ma l u s s i e v e r s i i (L e d.)R o e m]等苹果属 (Ma l u s M i l l)植物及西洋梨 (Pyr u s c o mm u n i s )等梨属(Pyr u s)植物。 A.2 地理分布 欧洲:德国、英国、乌克兰、俄罗斯、塞浦路斯 。 北美洲:加拿大、美国的俄勒冈州和华盛顿州 。 A.3 症状 P.p yr i侵染梨树时 ,在梨树枝干上形成溃疡或坏死 (见图A. 1) ,在嫩枝和果枝上形成干腐 。溃疡 的部位略凹陷 。嫩枝上的病菌通常是从修剪伤口侵入 。分生孢子器在死亡或干枯的树皮组织上形成 , 埋生或半埋生 ,在田间偶尔可见子囊盘 。详见8.