ICS67.050 CCSX04 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5451—2022 商品化试剂盒检测方法 乳酸菌总数 方法一 Commercial kit method—Lactic acid bacteria count—Test methodⅠ 2022-03-14发布 2022-10-01实施 中华人民共和国海关总署发布 以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 商品化试剂盒检测方法 乳酸菌总数 方法一 SN/T 5451—2022 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023) 编辑部:(010)65194242-7530 网址 www.customskb.com/book 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张0.75 字数21千字 2022年9月第一版 2022年9月第一次印刷 印数 1—500 * 书号: 155175·844 定价16.00元 以正式出版文本为准前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国福州海关、中华人民共和国长春海关。 本文件主要起草人:郑晶、林杰、郭菁、肖颖、徐珊、陈彬、柯璐、张温玲、戴晓丽、黄嫦娇、曾维扬、 刘阳、丁旭、王玮琳。 ⅠSN/T5451—2022 以正式出版文本为准以正式出版文本为准商品化试剂盒检测方法 乳酸菌总数 方法一 1 范围 本文件规定了食品中3MTM PetrifilmTM Lactic Acid Bacteria Count Plate(简称“3M乳酸菌测试 片”)的检测方法。 本文件适用于食品中乳酸菌总数的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅 该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB 4789.35—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27405 实验室质量控制规范 食品微生物检测 SN/T 2775 商品化食品检测试剂盒评价方法 SN/T 3266 食品微生物检验方法确认技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全和防止污染,应由具备资格的人员进行操作。所有培养物和废弃物应 按照GB 19489和GB/T 27405中的有关规定执行。 5 方法提要 3M乳酸菌测试片是一种预先制备好的培养基系统,包含培养基、选择剂、冷水可溶性凝胶剂和可 增强菌落计数效果的四唑指示剂,菌落在测试片上呈红色。测试片含有氧清除化合物,可形成一种利于 同型发酵与异型发酵乳酸菌再生恢复的厌氧环境。36 ℃±1 ℃需氧培养 48 h±3 h进行菌落计数。 6 仪器和设备 除微生物实验室常规灭菌和培养设备外,其他设备和材料如6.1~6.11所列。 6.1 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。 6.2 冰箱:2 ℃~5 ℃。 6.3 天平:感量为0.1 g。 1SN/T5451—2022 以正式出版文本为准6.4 均质器。 6.5 振荡器。 6.6 无菌吸管:1 mL(具0.01 mL刻度),10 mL(具0.1 mL刻度)或微量移液器及吸头。 6.7 无菌锥形瓶:容量250 mL、500 mL。 6.8 无菌培养皿:直径90 mm。 6.9 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 6.10 放大镜或/和菌落计数器。 6.11 3M压板。 7 试剂和材料 7.1 3M乳酸菌测试片(3MTM PetrifilmTM Lactic Acid Bacteria Count Plate):参考SN/T 2775和 SN/T 3266按商品化食品检测试剂盒评价程序进行了评价,评价结果参见附录A。 7.2 磷酸盐缓冲液(PBS):按附录B.1。 7.3 无菌生理盐水:按附录B.2。 7.4 1 mol/L 氢氧化钠(NaOH):称取 40 g NaOH 溶于1 000 mL 蒸馏水中。 7.5 1 mol/L 盐酸(HCl):移取90 mL浓盐酸 ,用蒸馏水稀释至1 000 mL。 8 检测程序 3M乳酸菌测试片检测方法程序见图1。 图1 3M乳酸菌测试片检测方法程序 2SN/T5451—2022 以正式出版文本为准9 操作步骤 9.1 样品制备和稀释 9.1.1 冷冻样品可先使其在2 ℃~5 ℃条件下解冻,时间不超过18 h,也可在温度不超过45 ℃的条件 解冻,时间不超过15 min。 9.1.2 固体和半固体食品:以无菌操作称取25 g样品,置于装有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的 无菌均质杯内,于8 000 r/min~10 000 r/min均质1 min~2 min,制成1∶10样品匀液;或置于 225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1 min~2 min,制成1∶10的 样品匀液。 9.1.3 液体样品:液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25 mL,放入装有225 mL磷酸 盐缓冲液或生理盐水的样品稀释瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分振摇,制成1∶10的样品 匀液。 9.1.4 用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1 mL,沿管壁缓慢注于装有9 mL稀释液 的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀, 制成1∶100的样品匀液。 9.1.5 另取1 mL无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作顺序,做10倍递增样品匀液,每递增稀释 一次,即换用1次1 mL灭菌吸管或吸头。 9.2 接种和培养 9.2.1 根据对待检样品乳酸菌含量的估计,选择2个~3个适宜稀释度样品匀液进行检验。 9.2.2 将3M乳酸菌测试片置于平坦表面处,揭开上层膜,吸取某一稀释度的1 mL样品匀液,垂直滴 加在测试片的中央处,然后将上层膜轻轻放下,将压板放置在上层膜中央处,压下压板使样液均匀覆盖 于圆形的培养面积上,切勿扭转压板。拿起压板,静置至少1 min以使培养基凝固。 9.2.3 每个稀释度接种两张测试片。同时,分别吸取1 mL空白稀释液加入两张测试片内作空白 对照。 9.2.4 将测试片的透明面朝上,水平置于培养箱内,可堆叠至20片。在36 ℃±1 ℃条件下需氧培养 48 h ± 3 h。 9.3 乳酸菌总数检验 9.3.1 如果样品仅包括乳杆菌属:取合适浓度的稀释液1 mL,滴加至乳酸菌测试片中央,置于36 ℃± 1 ℃下需氧培养48±3 h。则测试片上的菌落数即为乳酸菌总数。 9.3.2 如果样品同时包括乳杆菌属和双歧杆菌属:取合适浓度的稀释液1 mL,滴加至乳酸菌测试片中 央,置于36 ℃±1 ℃下需氧培养48±3 h。则测试片上的菌落数即为乳酸菌总数。 9.3.3 如果样品中同时包括乳杆菌属和嗜热链球菌:取合适浓度的稀释液1 mL,滴加至3M乳酸菌测 试片中央,置于36 ℃±1 ℃下需氧培养48±3 h。同时按照GB 4789.35—2016进行嗜热链球菌计数, 二者结果之和即为乳酸菌总数。 9.3.4 如果样品同时包括乳杆菌属、双歧杆菌属和嗜热链球菌:取合适浓度的稀释液1 mL,滴加至 3M乳酸菌测试片中央,置于36 ℃±1 ℃下需氧培养48±3 h。同时按照GB 4789.35—2016进行嗜热 链球菌计数,二者结果之和即为乳酸菌总数。 9.3.5 如果仅检测样品中双歧杆菌属,按照GB 4789.35—2016进行双歧杆菌计数。 9.3.6 如果样品仅包含嗜热链球菌,按照GB 4789.35—2016进行嗜热链球菌计数。 3SN/T5451—2022 以正式出版文本为准9.3.7 如果样品中同时包括双岐杆菌属和嗜热链球菌,按照GB 4789.35—2016分别进行双歧杆菌和 嗜热链球菌计数,二者结果之和即为乳酸菌总数。 9.4 菌落计数 9.4.1 到培养时间应立即计数,选取菌落数在 30 CFU~300 CFU之间的测试片计数菌落总数,记录 稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。 9.4.2 计数所有红色菌落,菌落伴有或无伴有气泡均需计数。 9.4.3 测试片上菌落浓度过高会导致整个生长区域变为深蓝色至紫色,并且在测试片边缘带有粉色晕 圈,将结果记录为“多不可计”。 9.4.4 3M乳酸菌测试片有30个等分格,当菌落数量过多计数困难时,可选择几个有代表性菌落的小 方格进行计数并计算平均菌落数,再乘以总方格数,即可得到整个测试片上的估算菌落数。 9.4.5 一些微生物会液化凝胶,造成局部扩散或菌落模糊的现象。如果液化现象干扰计数,可以计数 未液化的面积来估算菌落数。 9.5 计算方法 9.5.1 若只有一个稀释度测试片上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个测试片菌落数的平均值,再 将平均值乘