ICS67.050 CCSC53 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5439.4—2022 出口食品中食源性致病菌快速检测方法 PCR-试纸条法 第4部分:克罗诺杆菌 Rapid detection of foodborne pathogens from exported food by PCR-Lateral flow dipstick method—Part 4:Cronobacter 2022-03-14发布 2022-10-01实施 中华人民共和国海关总署发布 以正式出版文本为准前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件是SN/T 5439的第4部分。SN/T 5439已经发布了以下部分: ———第1部分:沙门氏菌; ———第2部分:金黄色葡萄球菌; ———第3部分:副溶血性弧菌; ———第4部分:克罗诺杆菌; ———第5部分:产志贺毒素大肠埃希氏菌及大肠埃希氏菌O157; ———第6部分:空肠弯曲菌; ———第7部分:单核细胞增生李斯特氏菌。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国南京海关、中华人民共和国上海海关、南京农业大学、合肥工业大 学、苏州蝌蚪生物技术有限公司、广东省科学院微生物研究所、广东环凯生物科技有限公司、杭州傲敏生 物科技有限公司。 本文件主要起草人:袁辰刚、孙欣、薛峰、蒋原、曾海燕、蔡淑珍、曲晓莹、申进玲、陈伟、曾德新、 戴建君、苏静、 陆寿祥、曾静。 ⅠSN/T5439.4—2022 以正式出版文本为准出口食品中食源性致病菌快速检测方法 PCR-试纸条法 第4部分:克罗诺杆菌 1 范围 本文件规定了出口食品中食源性致病菌-克罗诺杆菌快速检测的PCR-试纸条方法。 本文件适用于出口食品中克罗诺杆菌的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB 4789.40—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403—2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 克罗诺杆菌Cronobacter 其为革兰氏阴性无芽孢杆菌,具有周生鞭毛、有动力,兼性厌氧,大多数产黄毒素,具有α-葡萄糖苷 酶活性,是一种常见的病原菌。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid) dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonuleoside triphosphate) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid) FITC:异硫氰酸盐(fluorescein 5-isothiocyanate) Tris:三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane] 5 方法原理 对样品中克罗诺杆菌进行增菌培养后提取DNA,采用上游和下游引物分别经地高辛和异硫氰酸盐 标记的克罗诺杆菌的特异性检测引物进行PCR扩增。检测用试纸条上含有金标记的抗异硫氰酸盐的 抗体,可与PCR产物上的异硫氰酸盐标记分子结合,在检测线位置上有抗地高辛抗体,可与PCR产物 上的地高辛标记分子结合,从而显色。如模板未扩增,则无PCR产物与地高辛抗体及FITC抗体结合, 从而不能在检测线(T线)位置显示颜色。 1SN/T5439.4—2022 以正式出版文本为准6 试剂和材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂,实验用水符合GB/T 6682的要求。 6.1 引物 克罗诺杆菌扩增引物详见表1,靶基因序列参见附录A。 表1 试验用引物 致病菌种类 引物序列(5'→3') 5’端标记物 靶基因 片段长度 克罗诺杆菌F:5’-CAGGAGTTGAAGAGGTTTAACT-3’ 地高辛 ITS-lA R:5’-GTGCTGCGAGTTTGAGAGACTC-3’ 异硫氰酸盐ITS-G & ITS-lA250 bp 6.2 试剂 6.2.1 DNA提取液:20 mmoL/L Tris-HCl,2 mmol/L EDTA,1.2% Triton X-100(pH8.0)。 6.2.2 2×PCR预混液。 6.2.3 PCR引物。 6.2.4 试纸条:通过采购的原料试剂自行组装(参见附录B),或采用等效的商品化试纸条。 6.2.5 展开液:10 mmol/L Tris、1% BSA、1%(体积分数)Tween20以及浓度为0.05 mol/L的 NaOH;或采用等效的商品化产品。 7 仪器设备 7.1 离心机:离心力≥12 000 g。 7.2 微量移液器:100 μL~1 000 μL,20 μL~200 μL,0.5 μL~10 μL。 7.3 PCR仪。 7.4 恒温水浴锅:100 ℃±1 ℃。 7.5 天平:感量0.01 g。 7.6 pH计。 7.7 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 8 检验步骤 8.1 样品制备和增菌 按照GB 4789.40—2016的方法进行样品制备和增菌。 8.2 样品DNA提取 8.2.1 增菌液模板DNA的制备 对于8.1获得的增菌液,采用如下方法制备模板DNA: a) 吸取1 mL菌液加入1.5 mL离心管中,12 000 g离心3 min,弃上清; b) 加入1 mL 0.85%无菌生理盐水,完全溶解沉淀,12 000 g离心3 min,弃上清; 2SN/T5439.4—2022 以正式出版文本为准c) 加入100 μL DNA提取液混匀后沸水浴10 min,置冰上冷却; d) 12 000 g离心2 min,上清液即为模板DNA。 也可采用等效的商品化核酸提取试剂盒并按其说明提取核酸。 8.2.2 可疑菌落模板DNA的制备 对于8.1分离到的可疑菌落,可直接挑取可疑菌落再按照8.2.1 c)步骤制备模板DNA以待检测。 也可采用等效的商品化核酸提取试剂盒并按其说明提取核酸。 8.3 DNA浓度和纯度的测定 取5 μL DNA溶液加双蒸水稀释至1 mL,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260 nm和280 nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按公式(1)计算: c=A×N×50/1 000 …………………………( 1 ) 式中: c———DNA浓度,单位为纳克每微升(ng/μL); A———260 nm处的吸光值; N———核酸稀释倍数。 当A260/A280比值在1.7~1.9之间时,适宜于PCR扩增。 8.4 PCR 扩增 8.4.1 PCR反应体系 见表2。 表2 PCR反应体系 组分 总体积(25 μL) 2×PCR预混液 12.5 μL 上游引物 (10 μmol/L) 0.25 μL 下游引物 (10 μmol/L) 0.25 μL DNA模板a5 μL 无菌水 7 μL aDNA模板的浓度限定在10 pg/μL~10 ng/μL之间。 8.4.2 反应条件 95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35个循环后进入72 ℃, 7 min;4 ℃保存。 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用克罗诺杆菌DNA模板作阳性对照,用非克 罗诺杆菌DNA模板作阴性对照,用等体积的无菌水代替模板DNA作空白对照。 8.4.3 试纸条检测 取6 μL PCR产物,加入54 μL上样稀释液,混匀后垂直缓慢滴加于试条样品垫中,3 min观察 结果。 3SN/T5439.4—2022 以正式出版文本为准9 质量控制 以下条件有一条不满足时,实验视为无效: a) 空白对照:质控线变红,检测线未变红。 b) 阴性对照:质控线变红,检测线未变红。 c) 阳性对照:质控线变红,检测线变红。 10 结果判断与表述 10.1 结果判定 试纸条质控线变红色,且检测线变红色,PCR扩增产物为可疑阳性。可疑阳性产物经测序进行 确证。 试纸条质控线变红色 ,检测线不变色,PCR扩增产物为阴性。 10.2 表述 PCR产物试纸条检测为可疑阳性,同时测序结果正确者,继续按照传统方法进行分离,若确分离到 该菌,判为含克罗诺杆菌,表述为检出克罗诺杆菌; PCR产物试纸条检测为阴性,判为不含有克罗诺杆菌,表述为未检出克罗诺杆菌。 11 检测过程中防止交叉污染的措施 按照GB/T 27403—2008中附录D的规定执行。 12 废弃物处理 检测过程中的废弃物,收集后在焚烧炉中焚烧处理。 13 检出限 本文件所规定方法的最低检出限(LOD)为105CFU/mL。 4SN/T5439.4—2022 以正式出版文本为准附 录 A (资料性) PCR产物测序结果 克罗诺杆菌的基因扩增