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ICS67.050 CCSX04 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5438—2022 出口乳粉中核苷酸含量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of nucleotide in milk powder for export— LC-MS/MS method 2022-03-14发布 2022-10-01实施 中华人民共和国海关总署发布 以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国广州海关、广州医科大学。 本文件主要起草人:丁博、董洁、李荀、曾广丰、王璐、谢建军、陈文锐。 ⅠSN/T5438—2022 以正式出版文本为准以正式出版文本为准出口乳粉中核苷酸含量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1 范围 本文件规定了游离核苷酸含量的液相色谱-质谱/质谱测定方法。 本文件适用于乳粉和调制乳粉中游离核苷酸总量(包括胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、次黄嘌呤核 苷酸、鸟嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸5种核苷酸)的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件,不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19644—2010 食品安全国家标准 乳粉 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 乳粉 milk powder 以生羊、牛乳为原料,经加工制成的粉状产品(见GB 19644—2010)。 3.2 调制乳粉 formulated milk powder 以生牛(羊)乳或及其加工制品为主要原料,添加其他原料,添加或不添加食品添加剂和营养强化 剂,经加工制成的乳固体含量不低于70%的粉状产品(见GB 19644—2010)。 3.3 游离核苷酸 free nucleotide 以核苷酸分子独立形态存在生物体内的物质,包括胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、次黄嘌呤核苷酸、 鸟嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸5种核苷酸。 3.4 蛋白质沉淀 protein precipitation 一种样品前处理方法。通过向样品中加入可混溶的有机溶剂致使蛋白质沉淀。 3.5 多反应监测 multiple reaction monitoring(MRM) 一种在串联质谱中使用的定量分析方法,通过在串联质谱仪的第一级(Q1)锁定母离子并在第三级 (Q3)锁定子离子来测定分析物。 1SN/T5438—2022 以正式出版文本为准4 方法提要 采用水提取试样中的核苷酸,甲酸沉淀蛋白质后,液相色谱-质谱/质谱仪检测和确证,外标法定量。 5 试剂和材料 水采用GB/T 6682规定的一级水。 5.1 乙腈:色谱纯。 5.2 甲酸:色谱纯。 5.3 1%甲酸水溶液:准确吸取10 mL甲酸(4.2),用水定容至1 L,混匀。 5.4 0.1%甲酸水溶液:准确吸取1 mL甲酸(4.2),用水定容至1 L,混匀。 5.5 标准物质:核苷酸标准品(具体信息参见附录A),纯度均大于99%。 胞嘧啶核苷酸Cytidine monophosphate(CMP)C9H14N3O8P 腺嘌呤核苷酸Adenosine monophosphate (AMP)C10H14N5O7P 尿嘧啶核苷酸Uridine monophosphate (UMP)C9H13N2O9P 鸟嘌呤核苷酸Guanosine monophosphate (GMP) C10H14N5O8P 次黄嘌呤核苷酸Inosine monophosphate (IMP)C10H13N4O8P 5.6 标准储备液的配制:分别准确称取经纯度折算后的适量标准物质(精确到0.1 mg),用水溶解,难 溶的标准品,加少量1%甲酸水溶液(4.3)溶解,再用水定容至刻度,配制成浓度为1.0 mg/mL的标准 储备溶液。于4 ℃以下避光保存,有效期6个月。 5.7 混合标准溶液的配制:准确吸取标准储备液0.5 mL于10 mL 容量瓶中,用水定容至刻度,此标准 溶液浓度为50.0 mg/L,于4 ℃以下冰箱内储存,有效期1个月。 5.8 微孔滤膜:0.22 μm,有机相型。 6 仪器和设备 6.1 液相色谱-质谱/质谱联用仪:配有电喷雾离子源(ESI)。 6.2 超声波水浴。 6.3 涡旋混合器。 6.4 低温离心机:可制冷至4 ℃, 10 000 r/min。 6.5 均质器。 6.6 分析天平:感量0.1 mg和0.001 g。 6.7 聚丙烯离心管:50 mL,具塞。 6.8 移液枪,10 μL~1 000 μL,10 μL~100 μL,1 000 μL~5 000 μL。 7 测定步骤 7.1 提取 称取5.0 g均匀样品(精确至0.01 g),加30 mL水,振荡、超声至完全溶解,转移至100 mL容量瓶 中,定容至刻度;取20 mL样品溶液转移至50 mL容量瓶中,定容至刻度,获得稀释样品溶液; 取5 mL 稀释试样于50 mL容量瓶,加入120 μL~150 μL 1%甲酸溶液(4.3),超纯水定容至刻度线,置于超声 波清洗器中超声波提取10 min后(调制乳粉样品不超声直接静止30 min,提取核苷酸),在4 ℃下离心 2SN/T5438—2022 以正式出版文本为准20 min (转速10 000 r/min)。吸取上清液,用0.22 μm滤膜(4.9)过滤,待液相色谱-质谱/质谱仪测定。 7.2 混合标准工作溶液的配制 用水将核苷酸混合标准溶液(4.7)分别稀释为0.025 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、 0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、1.0 μg/mL的系列标准工作液。 7.3 测定 7.3.1 液相色谱参考条件 7.3.1.1 色谱柱 C18色谱柱,100 mm×4.6 mm (内径),3.5μm,或相当者。 7.3.1.2 柱温 柱温:40 ℃。 7.3.1.3 进样量 进样量:10 μL。 7.3.1.4 梯度洗脱 流动相、流速及梯度洗脱条件见表1。 表1 流动相、流速及梯度洗脱条件 时间/ min流速/ (μL/min)0.1%甲酸水溶液/% 乙腈/% 0 500 99 1 3.5 500 99 1 4.0 500 10 90 5 500 10 90 5.5 500 99 1 7.3.2 质谱参考条件 7.3.2.1 离子化模式 电喷雾离子源(ESI),ESI+模式。 7.3.2.2 扫描方式 多反应监测(MRM)。 7.3.2.3 分辨率 单位分辨率。 3SN/T5438—2022 以正式出版文本为准7.3.2.4 其他参考条件 其他参考条件参见附录B。 7.4 定性 在相同实验条件下,样品中待测物质的保留时间,与基质标准溶液的保留时间偏差在±2.5%之内; 每种化合物的质谱定性离子至少应包括一个母离子和两个子离子,且样品中各组分定性离子的相对丰 度与浓度接近的基质混合标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较,偏差不超过表2规定 的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物。 表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度/% >50 >20~50 >10~20 ≤10 允许的最大偏差/% ±20 ±25 ±30 ±50 7.5 定量 待测样液中核苷酸的响应值应在标准曲线线性范围内,超过线性范围则应稀释后再进样分析。核 苷酸标准溶液的多反应监测(MRM)色谱图参见附录C。 8 结果计算和表述 8.1 试样中游离核苷酸各组分的含量 试样中游离核苷酸各组分的含量X(CMP、UMP、GMP、IMP、AMP)分别按公式(1)计算: X=Ci×Vi×n mi×1 000×100 …………………………( 1 ) 式中: X———试样中核苷酸各组分的含量(分别是:CMP、UMP、GMP、IMP、AMP),单位为毫克每百克 (mg/100 g); Ci———试样溶液中核苷酸各组分的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL); Vi———试样溶液的体积,单位为毫升(mL); mi———试样的质量,单位为克(g); n———样液稀释倍数。 8.2 试样中游离核苷酸的总量 试样中游离核苷酸的总量按公式(2)计算: Z=CMP+AMP+UMP+GMP+IMP…………………………( 2 ) 式中: Z———试样中游离核苷酸的总量,单位为毫克每百克(mg/100 g); CMP———按公式(1)计算出的游离胞嘧啶核苷酸含量,单位为毫克每百克(mg/100 g); AMP———按公式(1)计算出的游离腺嘌呤核苷酸含量,单位为毫克每百克(mg/100 g); UMP———按公式(1)计算出的游离尿嘧啶核苷酸含量,单位为毫克每百克(mg/100 g); GMP———按公式(1)计算出的游离鸟嘌呤核苷酸含量,单位为毫克每百克(mg/100 g); 4SN/T5438—2022 以正式出版文本为准

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