̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS 65.020.20 CCSB16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5393—2022 山茶根结线虫检疫鉴定方法 Detection and identification of Meloidogyne camelliae Golden 1978 2022-07-07发布 2023-02-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 山茶根结线虫检疫鉴定方法 SN/T 5393—2022 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023) 编辑部:(010)65194242-7530 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张1.25 字数38千字 2023年1月第一版 2023年1月第一次印刷 印数 1—500 * 书号: 155175·708 定价21.00元̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:宁波检验检疫科学技术研究院、中华人民共和国宁波海关技术中心、宁波中盛产 品检测有限公司。 本文件主要起草人:顾建锋、方亦午、刘乐乐、陈先锋。 ⅠSN/T5393—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 山茶根结线虫检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了山茶根结线虫的检疫鉴定方法。 本文件适用于进出境种苗、土壤、介质及植物产品中山茶根结线虫的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 24829 毛刺线虫属(传毒种类)检疫鉴定方法 SN/T 1157 进出境植物苗木检疫规程 SN/T 2117 伪哥伦比亚根结线虫检疫鉴定方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 山茶根结线虫基本信息 学名:Meloidogyne camelliae Golden 1978。 英文名:Camelliae root-knot nematode。 分类地位:线虫门(Nematoda),色矛纲(Chromadorea),小杆目(Rhabditida),垫刃亚目(Tylenchi- na),垫刃总科(Tylenchoidea),根结科(Meloidogynidae),根结亚科(Meloidogyninae),根结线虫属 (Meloidogyne)。 山茶根结线虫其他相关信息见附录A。 5 方法原理 根结线虫二龄幼虫入侵寄主根部后固着寄生,逐渐发育为卵圆形或梨形雌虫,导致寄主根部膨大呈 根瘤状。但有时山茶根结线虫等种类雌虫露出根外(见附录B)。如发现疑似根结,可直接剖检寻找雌 虫,也可从寄主植物根系及根围土壤或介质中分离获得二龄幼虫或雄虫。获得线虫后,可进一步用形态 学、分子生物学或者上述方法相结合,并参考其寄主、地理分布等信息(见附录A),进行种类鉴定。 6 器材和试剂 6.1 仪器设备和器具 PCR仪、冷藏箱、体视显微镜、生物显微镜、超低温冰箱、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、高压灭菌 1SN/T5393—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 锅、微波炉、烘箱;改良线虫分离漏斗、医用解剖刀、载玻片、盖玻片、酒精灯、线虫挑针、PCR管、24孔细 胞培养板、可调式微量移液器(2 μL~1 000 μL)及相应的吸头。 6.2 主要试剂 除特别规定外,所有实验用试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T 6682中相关规定。 甲醛、乙醇、甘油、蜡块、指甲油、液氮、2×Taq MasterMix预混液、10×PCR 缓冲液(Mg2+ free)、 蛋白酶K(20 mg/mL)、限制性内切酶Hinf I、ddH2O、100 bp Marker、GelRed染料、50×TAE溶液、 琼脂糖凝胶。 7 现场检疫与取样 7.1 症状检查 现场检疫时应检查植株生长是否健康,挖取寄主植物根部,观察根上是否有根结或根瘤状畸形,或 生长不良、腐烂、变色、畸形等症状。 7.2 取样 按照SN/T 1157进行抽样和取样,对有根结等症状的重点取样。如无症状,则随机取样。对于进 境苗木,如样品数量不大于5株(份),要求对每株单独取1份样品。每份样品质量不小于500 g,取样深 度为土表下20 cm左右(采样时应多带些根,以便进一步分离雌虫)。样品数量大于5株(份),要求至少 取样5份。样品置密闭塑料袋中,标明品名、报检号、来源国、检测要求等信息,及时送实验室检测。如 小苗带土较少,则尽量多取根和土样,不带土的苗应仔细检查根部。土壤、介质或其他植物产品可参照 该方法。 8 实验室检验 8.1 线虫分离 实验室接到样品后应立即进行线虫分离。若不能及时分离,可将样品暂时保存于4 ℃冷藏箱中。 土壤、介质、根系等样品应用改良漏斗法分离线虫(按照GB/T 24829),根结可直接剖检分离线虫(按照 SN/T 2117)。 8.2 体视显微镜镜检 用改良漏斗法分离到的多数是根结线虫二龄幼虫,偶尔有雄虫。样品中根结线虫常与其他多种线 虫混杂,须注意区分。根结线虫二龄幼虫较细小,体长多在300 μm~500 μm,行动缓慢,虫体一般内含 物较多,颜色偏深。雄虫体长达1 000 μm~1 500 μm,行动缓慢。雌虫须剖开根结才能看到(但也有部 分根结线虫不引起明显的结节,或根结部分露出根表面),呈球形或近梨形,长500 μm~700 μm,宽 300 μm~500 μm,乳白色或近褐色。 8.3 标本制作 若镜检发现疑似根结线虫二龄幼虫或雄虫,需制作临时玻片或永久玻片进一步观察(按照 GB/T 24829)。发现雌虫,须制作会阴花纹永久玻片(按照SN/T 2117)。 8.4 生物显微镜观察、拍摄和测量 仔细观察雌虫、雄虫和二龄幼虫主要鉴定特征并显微拍摄,主要鉴定特征包括雌虫会阴花纹形态, 2SN/T5393—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 雌虫、雄虫和二龄幼虫的头部和口针形态 ,背食道腺开口到口针基球的距离 (d o r s a l gl a n d o r i f i c e, DGO) ,二龄幼虫的体长 、口针长度及基部球形态 、尾形及透明区长度等特征 。应在每张图片上加相应 标尺,测量并计算 :体长/虫体最宽处体宽 (a) 、体长/尾长(c) 、尾长/肛门处虫体直径 (c’ )等值。如样品 足够,应测量雄虫 、二龄幼虫各 2 0条以上。 9 形态学鉴定 9.1 二龄幼虫形态特征 (见附录C) 体长约5 0 0 μm (4 4 0 μm ~5 7 0 μm) ,头架骨化弱 ,唇区缢缩不明显 。体表环纹显著 ,虫体后部变粗 糙。侧线4条,约占体宽的 1/4。口针纤细 ,基部球显著 。中食道球卵圆形 ,瓣膜显著 。尾圆锥形 ,肛门 处体宽约 1 0. 8 μm (9. 6 μm~1 2. 7 μm) ,尾长约4 7 μm (4 0 μm ~5 6 μm) ,尾部粗环纹一直延伸到近尾 端,尾末端多数钝圆 ,偶尔钝尖 ,透明尾长 1. 4 μm~6. 6 μm(测计值见表 1) 。 表1 山茶根结线虫二龄幼虫测计值及与原始文献比较表 单位为微米 形态指标山茶根结线虫 (王江岭等 ,2 0 1 3)山茶根结线虫 (G o l d e n,1 9 7 8) n 2 5 7 0 体长5 1 2±2 6. 4 (4 6 2~5 6 0 )5 0 1±2 1 (4 4 3~5 7 6 ) 最大体宽1 7. 1±1. 5 (1 5. 4~2 1. 3 )— 口针长1 1. 6±0. 5 (1 0. 7~1 2. 3 )1 1. 6±0. 2 (1 1. 2~1 2 ) DGO3. 9±0. 6 (3. 1~5. 2 )3. 7±0. 4 (3~4. 5) 尾长4 6. 1±4. 1 (4 0. 4~5 5. 4 )4 7±3. 1 (4 0~5 6) 肛门处体宽1 0. 8±0. 9 (9. 6~1 2. 7 )— 透明尾长3. 7±1. 9 (1. 4~6. 6 )6. 3±1. 4 (4~8. 9) a3 0. 1±2. 9 (2 2. 6~3 3. 8 )2 6±1. 8 (2 1~3 0) c1 1. 1±1. 0 (9. 2~1 2. 7 )1 0. 7±0. 6 (9. 5~1 2 ) c '4. 3±0. 5 (3. 2~5. 1 )— 3S N/T5 3 9 3—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 9.2 雌虫形态特征(见附录D) 虫体梨形或球形,颈部明显。制片后观察,会阴花纹显著,呈星形,边缘常有角状突起,条纹多呈粗 绳状。阴门与肛门凹陷,与会阴花纹不在同一平面上。 9.3 雄虫形态特征(见附录D) 热杀死后虫体后端略腹弯。侧线4条。唇区略缢缩,头冠显著。口针粗壮,前端尖细,基部球圆。 DGO 4 μm~7 μm。单精巢,长约800 μm。交合刺稍向腹弯,末端钝圆。 9.4 主要鉴定特征 山茶根结线虫雌虫和二龄幼虫均较容易与其他种区分。其雌虫会阴花纹