̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS65.020.20 CCS B16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5390—2022 梨炭疽病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Colletotrichum gloeosporioides Penz.& Sacc. 2022-07-07发布 2023-02-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国乌鲁木齐海关、石河子大学。 本文件主要起草人:王翀、张祥林、张小菊、孙燕飞、李凤、徐金玉、韦薇、史向向。 ⅠSN/T5390—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 梨炭疽病菌检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了梨炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides的检疫鉴定方法。 本文件适用于相关寄主植物苗木等繁殖材料和植物产品中梨炭疽病菌的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 梨炭疽病菌基本信息 英文名:Pear Anthracnose 学名:Colletotrichum gloeosporioides Penz.& Sacc. 无性世代学名:Colletotrichum gloeosporioides 有性世代学名:Glomerella cingulata 分类地位:梨炭疽病菌属子囊菌门(Ascomycota)、盘菌目(Pezizales)、围小丛壳属(Glomerella);无 性态属半知菌亚门(Deuteromycotina)、黑盘孢目(Melanconiales)、炭疽菌属(Colletotrichum) 5 鉴定原理和流程 5.1 鉴定原理 梨炭疽病菌的症状表现、培养性状、形态学特征、致病性及PCR特异性扩增检测结果作为梨炭疽病 菌的检疫鉴定依据。 5.2 鉴定流程 鉴定流程见图1。 1SN/T5390—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 图1 鉴定流程 6 仪器设备和试剂 6.1 仪器设备 生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝 胶成像系统、电泳仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器。 6.2 主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。 6.2.1 1%次氯酸钠,DNA 提取相关试剂(盒),PCR相关试剂,电泳试剂。 6.2.2 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。 6.2.3 青/链霉素微酸性PDA培养基:将洗净后去皮的马铃薯200 g切碎,加水1 000 mL煮沸半小 时,用纱布滤去马铃薯,加水补足1 000 mL,然后加20 g葡萄糖和15 g~20 g琼脂,加热使琼脂完全溶 化后,分装在三角瓶中,调整pH值至5.6,121 ℃高压灭菌20 min。培养基冷却至约45 ℃时加入链霉 素或青霉素,使抗生素浓度为50~100个单位/mL,也可再加入3 mL乳酸(终浓度0.3%),倒入皿 备用。 7 检疫鉴定方法 7.1 取样和制样 挑选有下列症状的样品进行病原菌的分离(见附录A和附录B)。 7.1.1 叶片:有褐色圆形病斑或有同心轮纹的灰白色病斑,病斑相互融合成不规则形大斑。 7.1.2 枝条:有圆形、椭圆形或长条形深褐色小斑,病斑干缩凹陷,病部皮层与内部组织深褐色枯死。 7.1.3 果实:果面有淡褐色水渍状的小圆斑,色泽深,软腐下陷,或病斑表面颜色深浅交错,具明显的同 心轮纹。在病斑处的表皮下有褐色或黑色隆起的小粒点,或可见突破表皮,粉红色的粘质物(即病菌的 分生孢子盘)。果实整个腐烂或成僵果。 7.2 分离培养 将挑选出的可疑叶片、枝条或果实等植物组织进行分离,用无菌刀片切取病健交界处3 mm~ 5 mm的组织进行培养。病斑处表皮下有小粒点的,可以直接用挑针挑取移至培养基上培养。无菌条 2SN/T5390—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 件下将供试材料用1%次氯酸钠表面消毒5 min~10 min,无菌水洗3次。将处理好的材料置于含青/ 链霉素微酸性的PDA培养基平板上,每皿放置5块左右组织,于25 ℃下12 h光照黑暗交替培养。1 d 后开始观察,若发现白色或灰色的可疑菌落,立即用PDA培养基进行纯化。在无菌条件下挑取菌丝制 片,于显微镜下观察菌丝和分生孢子形态。 7.3 PCR检测 将分离出的病原菌接种到PDA培养基上,于25 ℃下培养5 d,挑取菌丝,用CTAB法或商业化试 剂盒提取供试菌株DNA,进行常规PCR检测(按照附录C)。PCR扩增产物检测中,阳性样品应出现 197 bp的泳带。 7.4 致病性测定 致病性测定为选做。 将形态特征与梨炭疽病菌相符且PCR检测阳性的分离物进行致病性测定。选用健康的梨果实进 行致病性测定,对梨果实进行表面消毒,无菌水冲洗,进行针刺接种。用灭菌牙签或刀片在果皮处穿刺 或切开组织,用无菌打孔器在培养基上取梨炭疽病菌菌丝块,接种在伤口上,用湿润的脱脂棉包裹伤口, 用塑料袋覆盖,28 ℃左右,相对湿度100%,黑暗条件下保湿48 h,接种后5 d~10 d后观察接种点附近 是否出现可疑病斑,观察症状并对果实发病处再做病原菌分离,若接种样品中分离出的菌株培养性状和 形态特征符合第8章中描述,且PCR扩增结果呈阳性,可判定致病性测定阳性。 8 形态学鉴定特征 病菌在PDA上菌落通常圆形,边缘整齐,平坦,气生菌丝呈毡状或絮状,较致密,平铺,直立,均匀, 易在菌落表面产生桔红色粘孢团;5 d左右菌丝体从无色变为灰色、橄榄绿、褐色或黑褐色,菌丝白色至 灰白色,渐变为深灰色,絮状或绒状,菌落反面深灰绿色,后期变深灰色;6 d后有明显的小黑点,即病菌 的分生孢子盘;分生孢子梗圆柱状,无色单孢,不分枝;分生孢子无色单孢,有油球,圆柱形或椭圆状,两 端钝圆,有的略弯,大小为(10.8 μm~25.5 μm)×(4.5 μm~5.5 μm)。 9 结果判定 若分离样品符合7.1描述的症状,分离菌株的特征符合或与第8章中描述相近,PCR扩增结果呈 阳性,判定检出梨炭疽病菌,否则判定未检出梨炭疽病菌。 10 记录和样品保存 10.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出梨炭疽病菌的样品应保存于4 ℃冰箱中,以备复核。 该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。 10.2 菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为梨炭疽病菌的菌株,应妥善保存。将菌株接种于PDA培养基斜面上, 于20 ℃~25 ℃下培养5 d,4 ℃冰箱保存;或将菌丝块转入30%灭菌甘油,4 ℃冰箱保存;或将菌株冷冻 干燥后,-40 ℃以下冰箱保存。 3SN/T5390—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 10.3 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并要有实验人员 和审核人员的签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。 4SN/T5390—2022