中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5363 —2022 鲤浮肿病检疫技术规范 Quarantine protocol for Carp edema virus disease 2022 -03-14 发布 2022 -10-01 实施ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国海关总署 发 布中华人民共和国出入境检验检疫 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号 （100023） 编辑部：（010）65194242-7530 网址 www.customskb.com/book 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本 880×1230 1/16 印张 0.75 字数 21 千字 2022 年 9 月第一版 2022 年 9 月第一次印刷 印数 1—500 书号：155175·322 定价：16.00 元鲤浮肿病检疫技术规范行 业 标 准 SN/T 5363—2022 * * *SN/T 5363—2022I前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国杭 州海关、河南省水产技术推广站。 本文件主要起草人： 温智清、贾鹏、郑晓聪、王津津、徐慧 、杨雪冰、李旭东、何俊强、刘荭、 史秀杰、兰文升、于力、刘莹、杨锦舜、王飞。1 SN/T 5363—2022鲤浮肿病检疫技术规范 1 范围 本文件规定了鲤浮肿病的 Nested PCR 和实时荧光 PCR 检测方法。 本文件适用于鲤浮肿病的流行病学调查、监测、诊断和进出境检疫。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。CEVD ：鲤浮肿病（Carp edema virus disease） ； CEV ：鲤浮肿病毒（Carp edema virus） ； PCR ：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） ；Ct ：循环阀值（cycle threshold） ； CTAB ：十六烷基三甲基溴化胺（Cetyltrimethylammonium Ammonium Bromide） ； DNA ：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid） ；dNTPs ：脱氧核糖核苷酸（Deoxynucleotide Triphosphates） ； EB ：溴化乙锭（Ethidiumbromide） 。 4 设备和器械 4.1 普通冰箱和 -80 ℃超低温冰箱。 4.2 制冰机。 4.3 二级生物安全柜。 4.4 无菌组织研磨器。 4.5 冷冻高速离心机。 4.6 PCR 仪。 4.7 实时荧光 PCR 仪。2 SN/T 5363—20224.8 水平电泳仪。 4.9 凝胶成像仪。 4.10 高压灭菌锅。 4.11 不同规格微量移液器，量程包括 0.5 mL~10 mL、10 mL~100 mL、100 mL~1000 mL。 4.12 剪刀、镊子、酒精棉球、离心管和 PCR 管等耗材。 5 试剂 5.1 水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 5.2 磷酸盐缓冲液（见附录 A.1） 。 5.3 CTAB 溶液（见附录 A.2） 。 5.4 抽提液 1（见附录 A.3） 。 5.5 抽提液 2（见附录 A.4） 。 5.6 无水乙醇，分析纯。 5.7 TE 缓冲液（见附录 A.5） 。 5.8 10×PCR 扩增缓冲液（见附录 A.6） 。 5.9 Tap 酶： -20 ℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 5.10 dNTPs ：含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmol/L。 5.11 TEB 电泳缓冲液（见附录 A.7） 。 5.12 溴化乙啶（见附录 A.8） 。 5.13 6× 上样缓冲液（见附录 A.9） 。 5.14 2× 实时荧光 PCR 预混液（见附录 A.10） 。 5.15 Nested PCR 用引物，浓度为 20 μmol/L，序列如下： CEV For B: 5 ’-ATGGAGTATCCAAAGTACTTAG-3 ’ CEV Rev J2: 5 ’-CCTCATCCAAATTACGTAGTAAAG-3 ’ 第一步 PCR 扩增产物为 493 bp 大小的片段。 CEV ForB-int: 5 ’-GTTATCAATGAAATTTGTGTATTG-3 ’ CEV RevJ-int3: 5 ’-GTTGATACAATTCCAGAGCAAG-3 ’ 第二步 PCR 扩增产物为 426 bp 大小的片段。 5.16 实时荧光 PCR 用引物和探针：浓度为 10 μmol/L，序列如下： CEV-qf ：5 ’-AGTTTTGTAKATTGTAGCATTTCC-3 ’ CEV-qr ：5 ’-GATTCCTCAAGGAGTTDCAGTAAA-3 ’ 探针 : 5 ’-FAM-AGAGTTTGTTTCTTGCCATACAAACT-BHQ-3 ’ 6 临床症状 发病鱼游动迟缓，在水面漫游或在池塘边缘静置不动，游动时失去平衡或沉于池底侧睡，当受 到惊吓等刺激时，病鱼立即游动，但很快又处于昏睡状态（其他参见附录 B） 。 7 采样 采样对象包括健康的、发病的和濒死的锦鲤和鲤等鲤科鱼类，采样数量按照 GB/T 18088 规定执行。 鳃是 CEV 的靶器官，脑、脾、肾、心脏和肠道也可作为采样组织器官，但肝脏除外。体长≤ 4 cm 的鱼苗取整条鱼；4 cm~6 cm 的鱼苗取所有内脏（含肾脏和鳃） ；体长＞ 6 cm 的鱼取鳃 ( 用酒精3 SN/T 5363—2022棉球去除鳃表面黏液 )、脑、肾和脾。 样品采集后，应尽快送到检疫实验室，一般不超过 24 h。若条件有限，发病鱼可取靶器官并浸泡 至 80 %~100 % 乙醇中保存，运送至检疫实验室。 8 诊断方法 8.1 Nested PCR 方法 8.1.1 设立对照 从提取样品 DNA 起，均需设立阳性对照、阴性对照和空白对照。取已知含有 CEV 的病鱼组织作 为阳性对照；取健康鱼组织作为阴性对照；取等体积的无菌去离子水作为空白对照。 8.1.2 核酸提取（CTAB 法） 无菌条件下，将取得的组织在无菌研钵进行匀浆，计重后用预冷的磷酸盐缓冲液以 1∶5（w/v） 将组织重悬，4 ℃、8 000 r/min 离心 5 min，取上清液待检。 取 450 μL 组织悬液加入 1.5 mL 的离心管，加 450 μL CTAB 溶液，充分混匀，25 ℃水浴作用 2.5 h。 向离心管中加 600 μL 抽提液 1，剧烈震荡混匀 30 s 以上，12 000 r/min 离心 5 min。取上层水相（约 800 μL） 至新的离心管，加 700 μL 抽提液 2，震荡混匀 30 s。 12 000 r/min 离心 5 min。 小心取上层水相 （约 600 μL）至新的离心管，加入 1.5 倍体积的预冷无水乙醇（约 900 μL） ，上下颠倒混匀后， -20 ℃沉淀 核酸 2 h 以上。12 000 r/min 离心 30 min，弃上清液。将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥 30 min。向 DNA 沉淀中加 50 mL TE 缓冲液， -20 ℃保存备用。 可使用同等效果的商品化核酸提取试剂盒代替以上方法。 8.1.3 第一步 PCR 反应 在反应管中加入 10×PCR 扩增缓冲液 5 μL、上下游引物 （20 μmol/L） 各 1 μL、dNTP （10 mmol/L） 1 μL、Taq 酶（5 U/ μL）1 μL，DNA 模板 5 μL，加双蒸水至总体积 50 μL。将反应管瞬时离心后，置 于 PCR 仪。 反应条件为：95 ℃预变性 5 min ；95 ℃变性 1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 30 s，35 次循环； 72 ℃再延伸 10 min。 第一步反应结束后可先将 PCR 产物进行电泳分析，若出现 493 bp 大小目的条带，可直接进行测 序分析，否则需进行第二步 PCR 反应。 8.1.4 第二步 PCR 反应 在反应管中加入 10×PCR 扩增缓冲液 5 μL、上下游引物 （20 μmol/L） 各 1 μL、dNTP （10 mmol/L） 1 μL、Taq 酶（5 U/ μL） 1 μL，第一步扩增产物 5 μL，加双蒸水至总体积 50 μL。将反应管瞬时离心后， 置于 PCR 仪。 反应条件为：95 ℃预变性 5 min ；95 ℃变性 1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 30 s，35 次循环； 72 ℃再延伸 10 min。8.1.5 琼脂糖凝胶电泳 用 TBE 电泳缓冲液配制 1.5 % 的琼脂糖（含 0.5 μg/mL EB）凝胶板。将其放入水平电泳槽，使电泳 缓冲液刚盖过胶面。取 5 μL PCR