以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 进出口食品化妆品专业分析方法验证指南   第 4 部分：分子生物学方法 Guideline on validation of test methods for food and cosmetics of import and export —Part 4: Molecular biological method 2023 -12-29发布 2024 -07-01 实施ICS 67.050 CCS X 04 中华人民共和国海关总署 发 布SN/T 5326.4 —2023以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5326.4—2023I前  言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件是 SN/T 5326《进出口食品化妆品专业分析方法验证指南》的第 4 部分。SN/T 5326 已经发 布了以下部分： ——第 1 部分：通用指南； ——第 2 部分：化学方法；——第 3 部分：传统微生物学方法； ——第 4 部分：分子生物学方法； ——第 5 部分：免疫学方法。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国天津海关、天津师范大学、大连民族大学、韶关学院（广东省 粤北食药资源利用与保护重点实验室） 、中国人民警察大学、中华人民共和国深圳海关。 本文件主要起草人：赵良娟、郑文杰、郑秋月、刘伟、张宏伟、曹际娟、张霞、王洪海、季超、 岳振峰。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5326.4—2023进出口食品化妆品专业分析方法验证指南    第 4 部分：分子生物学方法 1 范围 本文件规定了进出口食品化妆品核酸扩增检验类分子生物学方法的验证指南。 本文件适用于进出口食品化妆品核酸扩增检验类分子生物学方法标准建立过程中方法的验证。此 外，实验室采用非标准方法及自主研究开发新方法时，可参照本指南用以验证这些方法的适用性。 2   规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6379.2 测量方法与结果的准确度（正确度与精确度） 第 2 部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法 SN/T 5326.1 进出口食品化妆品专业分析方法验证指南 第 1 部分：通用指南 SN/T 5326.2— 2020 进出口食品化妆品专业分析方法验证指南 第 2 部分：化学方法 SN/T 5326.3— 2020 进出口食品化妆品专业分析方法验证指南 第 3 部分：传统微生物学方法 3   术语和定义 SN/T 5326.1 和 SN/T 5326.2— 2020 界定的术语和定义适用于本文件。 4   分子生物学方法性能参数 4.1   验证参数的选择 4.1.1   验证参数的选择 根据所制定方法的预期用途选择合适的验证参数，对于不同类型的分子生物学检验方法，验 证参数的选择见表 1。 表 1   典型验证参数的选择 方法类型 特异性 正确度a重复性 再现性 检出限 定量限 线性 扩增效率 定性方法 √ √ — — √ — — — 定量方法 √ √ √ √ √ √ √ √ 注：“√”为必选参数； “—”为不需选的参数。 a 定性方法的正确度为相对正确度。以正式出版文本为准2 SN/T 5326.4—20234.1.2 定性方法 实验室内验证由标准方法的起草单位完成，应至少验证特异性、正确度和检出限。实验室间 验证由除标准起草单位以外的协同实验室完成，对于定性方法，至少需要验证方法的正确度。 4.1.3   定量方法 实验室内验证由标准方法的起草单位完成，需要验证方法的全部技术参数。实验室间验证由 除标准起草单位以外的协同实验室完成，对于定量方法，至少需要验证方法的正确度、重复性和 再现性。 4.2   性能指标 4.2.1 定性方法应达到以下性能指标： a） 特异性：包容性检测结果 100% 为阳性；排他性检测结果 100% 为阴性； b） 相对正确度≥ 95%。 4.2.2 定量方法应达到以下性能指标。 a） 特异性：包容性检测结果 100% 为阳性；排他性检测结果 100% 为阴性。 b） 正确度：相对偏差≤ 25% 或 75% ≤回收率≤ 125%。 c） 重复性：相对标准偏差（RSDr）≤ 25%。 d） 再现性：相对标准偏差（RSDR）<35%。 e） 线性：R2 系数≥ 0.98。 f） 扩增效率：90% ≤扩增效率≤ 110％。 5   分子生物学方法性能参数的验证 5.1   验证样品的准备 验证样品的准备参照 SN/T 5326.2— 2020 中的 5.1。 5.2   方法性能参数的验证 5.2.1   特异性 特异性包含包容性和排他性。包容性指能够检测出属内的几个种或者种内的几个亚种，它体 现了一个筛查方法的应用范围。排他性指方法能够检测出目标靶基因，而不能检测出所有可能发 生交叉反应的其他基因；排他性的评估可以选择与目标基因种亲缘关系较远的种属。 验证方法参照 SN/T 5326.3—2020 中的 5.1.9。 至少需要 30 个目标靶基因样品进行包容性试验； 至少需要 20 个已知在一般情况下对目标基因有干扰的非目标基因的样品进行排他性试验。验证样品的浓度要求在 LOD 的 100 倍以上。 5.2.2   正确度 5.2.2.1   定性方法的正确度 定性方法的正确度是相对正确度（RT） 。相对正确度的验证至少需要 60 个样品，其中阳性样 品数量大约占样品总数的 25%~75%。检测结果填入表 2。以正式出版文本为准3 SN/T 5326.4—2023项目样品的真实状态 阳性参考样品 D+ 阴性参考样品 D- 检测结果阳性结果 T+ TP FP 阴性结果 T - FN TN 注：D+、D- 表示样品的真实状态，其中 D+ 表示阳性参考样品，D- 表示阴性参考样品；T+ 表示阳性检测结果， T- 表示阴性检测结果，TP 表示真阳性（T+/D+） ，FP 表示假阳性（T+/D-） ，FN 表示假阴性（T-/D+） ，TN 表示真 阴性（T-/D-） 。表 2 定性方法的相对正确度 相对正确度按公式（1）计算： RT= （TP+TN） / （TP+FP+TN+FN） …………………………… （1） 5.2.2.2   定量方法的正确度 5.2.2.2.1   验证方法 验证方法参照 SN/T 5326.2— 2020 中的 5.2.5。 5.2.2.2.2   采用标准样品验证方法的正确度   如果可获得标准样品，应优先采用标准样品验证方法的正确度。对于每一种基质，应至少采 用 3 个浓度水平，应包含方法测定范围的低浓度水平和高浓度水平；对于每一浓度水平，需要至 少进行 6 次平行独立试验，计算平均值对于标准样品接受参照值的相对偏差。 5.2.2.2.3   使用标准添加样品验证方法的正确度   如果无法获得标准样品，在空白样品基质中加入已知量的分析物，测定回收率。 示例如下： a） 选择 3 组共 18 份空白基质，每组中添加大约 1 倍、2 倍和 10 倍定量限的分析物； b） 分析样品并计算每个样品中分析物的浓度，计算每个浓度水平的平均回收率。 5.2.3   重复性   重复性验证要求采用正确度验证的浓度水平，每个浓度水平 3 个 ~5 个样品，每个样品重复 测 试2次 ~3 次。每一次重复测试都是一次独立的样品测试（包括核酸提取和扩增） 。 注：不允许从 1 份核酸提取物中进行 3 个平行扩增。 定量方法的重复性具体按照 GB/T 6379.2 中的方法进行计算。 5.2.4   再现性   定量方法的再现性验证按照 5.2.3 步骤进行。再现性具体按 GB/T 6379.2 中的方法进行计算。 5.2.5   检出限（LOD） 在方法测定范围的低浓度范围，按梯度倍比关系 （例如 80 拷贝、60 拷贝、40 拷贝、20 拷贝、 10 拷贝、5 拷贝和 1 拷贝）制备系列样品，每个浓度 1 个样品。每个样品进行 10 次测试。所有10 次平行实验均为阳性时的一系列浓度中的最低浓度即为 LOD。以正式出版文本为准4 SN/T 5326.4—20235.2.6 定量限（LOQ） 定量限验证试验与检出限验证试验相同。LOQ 是测试结果 RSD 低于 25% 的一系列浓度中的 最低浓度。RSD 具体按照 GB/T 6379.2 中的方法进行计算。 5.2.7   线性 R2系数  采用一个已知浓度的目标靶基因样品，进行梯度倍比稀释（例如 340000 拷贝、34000 拷贝、 17000 拷贝、3400 拷贝、1700 拷贝、340 拷贝、170 拷贝、34 拷贝和 17 拷贝） 。至少重复 2 次 ~3 次 核酸扩增试验，将稀释后浓度的对数值与所得阈值循环数（Ct）值采用最小二乘法进行线性拟合 获得 R2。 5.2.8   扩增效率 扩增效率是指一个循环后的产物增加量与这个循环的模板量的比值，其值位于 0 ~1 之间。利 用