̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS65.020.01 CCSB16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4876.9—2022 DNA条形码方法 第9部分:检疫性大小蠹 Method for DNA barcode—Part 9:Dendroctonus 2022-07-07发布 2023-02-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件为SN/T 4876《DNA 条形码方法》的第9部分,SN/T 4876已发布以下部分: ———第1 部分:检疫性乳白蚁; ———第2 部分:检疫性断眼天牛; ———第3 部分:检疫性卷蛾; ———第4 部分:检疫性高梁属; ———第5 部分:曼陀罗属; ———第6 部分:瘤背豆象属; ———第7 部分:一品红亚属; ———第8 部分:莬丝子属; ———第9 部分:检疫性大小蠹。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国南京海关、中华人民共和国苏州海关、中华人民共和国杭州海关、 中华人民共和国宜兴海关。 本文件主要起草人:杨晓军、安榆林、郑斯竹、叶兼菱、林晓佳、伏建国、吴晶、梁照文。 ⅠSN/T4876.9—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э DNA条形码方法 第9部分:检疫性大小蠹 1 范围 本文件规定了用DNA条形码试剂盒检测技术对中国进境植物检疫性大小蠹进行基因条码筛查的 鉴定方法。 本文件适用于国境口岸开展检疫性大小蠹种类分子鉴定的植物检疫实验室。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 SN/T 4174 美云大小蠹检疫鉴定方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA条形码 DNA barcoding DNA条形码技术是利用标准化的、有足够变异的、易扩增且相对较短的基因片段,用于物种鉴定和 新种发现的生物身份识别技术。 3.2 线粒体DNA mitochondrial DNA 简称mtDNA,线粒体中的遗传物质,是在细胞线粒体内发现的脱氧核糖核酸特殊形态。线粒体基 因组是裸露的DNA双链分子,主要呈环状,可参与蛋白质的合成,转录与复制。特点是突变率高,母系 遗传。 3.3 细胞色素氧化酶亚基Ⅰ cytochrome oxidase subunit Ⅰ 由线粒体DNA编码,基因总长约1 544 bp的一类细胞色素氧化酶亚基。 3.4 凭证标本 voucher specimen 凭证标本是一种为鉴定或研究提供实物依据并具有足够存档信息(采集及鉴定信息等)而长期保存 的标本,它可以是完整的生物个体或其一部分,也可以是生物体的遗传物质。模式标本也属凭证标本。 凭证标本记录的存档信息应具有追溯性。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 1SN/T4876.9—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э COⅠ:细胞色素氧化酶亚基Ⅰ DNA:脱氧核糖核酸 PCR:聚合酶链式反应 ddH2O:双蒸水 μL:微升 mg/mL:毫克/毫升 TE缓冲液:Tris-EDTA 缓冲液 TAE缓冲液:Tris-乙酸 缓冲液 r/min转/分钟 5 检疫性大小蠹基本信息 原农业部2007年5月29日发布的第862号公告《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》 中将大小蠹(红脂大小蠹和非中国种)Dendroctonus spp.(valens LeConte and non-Chinese)列为我国进 境植物检疫性有害生物。大小蠹属Dendrotonus昆虫隶属于鞘翅目Coleptera、小蠹科 Scolytidae、海小 蠹亚科Hylestininae、根小蠹族Hylurgini。该属在全世界共记录19种,其中北美洲分布17种,欧洲和 亚洲共2种。我国本土的大小蠹仅有华山松大小蠹Dendroctonus armandi和云杉大小蠹D.micans, 主要分布在陕西、四川、黑龙江、辽宁和青海省(参见附录表A.1)。 6 方法原理 形态学上符合大小蠹属昆虫形态特征的未知大小蠹,根据其COⅠ基因序列特征及多态位点规律, 作为物种的鉴定特征,确定目标大小蠹是否为检疫性大小蠹。 7 器材和试剂 7.1 器材 至少应配置以下仪器设备: 常规PCR仪;微量分光光度仪;核酸电泳仪凝胶成像系统;台式冷冻离心机;超纯水系统;旋涡振荡 器;微量移液器(0.5 μL,2.5 μL,10 μL,20 μL,200 μL,1 000 μL)及配套抢头;PCR反应管(0.2 mL, 0.5 mL);冰箱;体视显微镜。 7.2 试剂 应至少购置如下试剂或者相应的动物基因组提取试剂盒: 裂解缓冲液;TE缓冲液;TAE缓冲液;蛋白酶K;EB;琼脂糖;ExTaq聚合酶;DL2000 Marker; PCR MasterMix;引物。 本文件使用的扩增引物为ZINK3/ZINK2,上游引物ZINK3:TAGATGTGGACACCCGAGCCT, 下游引物ZINK2:AGTTAGTCCTGCGAAGAG,产物大小为325 bp。 8 DNA条形码鉴定 8.1 样品的采集与处理 样品的采集见SN/T 4174美云大小蠹检疫鉴定方法。应尽可能选择新鲜标本,标本宜保存于无水 2SN/T4876.9—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 乙醇中,每份标本(或组织)单管保存,并做好唯一性标识。 8.2 核基因组的制备 取部分大小蠹肌肉组织于双蒸水中漂洗,吸水纸吸干后可采用商品化动物基因组提取试剂盒,或传 统的CTAB基因组提取方法进行动物基因样本的制备,制备好的基因进行浓度及纯度测定后,保存至 -20 ℃冰箱备用。 8.3 核酸的质量检测 完整性检测:通过凝胶电泳检测DNA为明亮单一的条带。 纯度检测:DNA:OD260/OD280在1.7~1.9之间,OD260/OD230在1.9~2.1之间。 8.4 PCR检测 8.4.1 检疫性大小蠹COⅠ基因PCR反应体系 按表1顺序依次加入。 表 1 检疫性大小蠹COⅠ基因PCR反应体系(以50 μL为例) 成分 体积/μL 模板 1 引物1 1 引物2 1 2×Mastermix 25 ddH2O 22 8.4.2 检疫性大小蠹COⅠ基因PCR的反应程序 按表2设置。 表 2 检疫性大小蠹COⅠ基因PCR反应程序(适用ZINK3/ZINK2引物对) 步骤 反应温度/℃ 时间 循环数 预变性 94 2 min — 变性 94 45 s 35 退火 45 30 s 35 延伸 72 45 s 35 延伸 72 10 min — 8.4.3 琼脂凝胶电泳 反应结束后取扩增产物5 μL,采用1.5%的琼脂糖凝胶,1X电泳缓冲液TAE,在稳压150 V下电 泳约30 min,EB染色,凝胶成像系统观察、拍照。 8.5 测序 使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序,PCR扩增引物作为测序引物,测序原理同Sanger测 3SN/T4876.9—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 序法。为确保测序结果的可靠性,需对测序质量进行评估,去除测序结果两端的低质量序列,质量评估 以碱基的Q值为依据。应用软件进行序列拼接,去除引物区,获得相应的DNA序列,序列方向应与 PCR扩增正向引物方向一致。 9 结果判定 9.1 国际通用数据库判定 登录GenBank数据库BLAST鉴定系统(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),将应用引物 ZINK3/ZINK2扩增出的未知大小蠹序列输入“Nucleotide BLAST”模块进行结果搜索,大小蠹种类名 单见附录表A.1。在BLAST结果中查看序列相似性最高的物种,相似序列应为附录表A.2中所列序 列,且相似度需大于98%,即可判定检出相应的大小蠹种类。 9.2 植物有害生物检疫鉴定系统判定 登录植物有害生物检疫鉴定系统,使用“基因条码”模块对查询序列所属的“属”进行分析比对,结果 中相似性最高的“属”为查询序列所属类群(参见附录图B.3)。选择该“属”“更多比对结果”模块里,点 击“开始对比”,将符合该类群鉴定特征的且相似度为100%的物种判定为该未知种。 10 标本与原始数据保存 10.1 标本保存 采集到的标本应100%乙醇浸渍低温-20 ℃保存,并注明货物来源,寄主,采集时间、地点及采集 者,保存期为1年,以备复验,如涉及贸易纠纷则须保存到纠纷解决完毕。保存期满后,按后期用途长久 保存或处理。 10.2 原始数据保存 样品检测结束后,其原始记录单和检验报告或证书须归档,妥善保管,以备复验、谈判和仲裁。 4SN/T4876.9—2022