̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS59.080.99 CCSW09 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4656.9—2023 进出口纺织品生物安全检验方法 第9部分:肠出血性大肠杆菌O157:H7 Biosafety testing methods of the textiles for import and export— part 9:Entero-hemorrhagic E.coli O157:H7 2023-05-05发布 2023-12-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件为SN/T 4656《进出口纺织品生物安全检验方法》的第9部分,SN/T 4656已经发布了如下 几个部分: ———第1部分:白假丝酵母菌; ———第2部分:大肠埃希氏菌; ———第3部分:大肠菌群; ———第4部分:金黄色葡萄球菌; ———第5部分:菌落总数; ———第6部分:沙门氏菌; ———第7部分:铜绿假单胞菌; ———第8部分:通则; ———第9部分:肠出血性大肠杆菌O157:H7。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位: 中华人民共和国郑州海关、中检集团中原农食产品检测(河南)有限公司、中华人 民共和国宁波海关、中华人民共和国深圳海关。 本文件主要起草人: 李轲、郭会清、禹建鹰、李传民、张亚斌、宗珊盈、谢堂堂、傅科杰、张卫理。 ⅠSN/T4656.9—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 进出口纺织品生物安全检验方法 第9部分:肠出血性大肠杆菌O157:H7 1 范围 本文件规定了进出口纺织品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的检验方法。 本文件适用于进出口纺织品肠出血性大肠杆菌O157:H7的检验。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 1538.1 培养基制备指南 第1部分:实验室培养基制备质量保证通则 SN/T 1538.2 培养基制备指南 第2部分:培养基性能测试实用指南 SN/T 4656.8 进出口纺织品生物安全检验方法 第8部分:通则 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 纺织品生物安全 biosafety of textiles 一般是指纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁,及 对其所采取的一系列有效预防和控制措施。 3.1.2 肠出血性大肠杆菌O157:H7 Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 肠出血性大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠杆菌的主要致病菌株,是与公共卫生有关的最重要 的出血性大肠杆菌的血清类型,是一种可引起人或牲畜肠出血性腹泻等疾病的细菌性病原体。此病原 细菌为革兰氏染色阴性、两端钝圆的短杆菌,最适生长温度为37 ℃,不发酵或迟缓发酵山梨醇,不能分 解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)产生荧光。 3.1.3 实时荧光 PCR real time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光化学物质的积累实时监测PCR扩增产物总量的方法。 3.1.4 Ct值 Cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 1SN/T4656.9—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 MUG(4-Methylumbellifery-β-D-Glucuronide):4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷。 PCR(polymerase chain reaction):聚合酶链式反应。 DNA (deoxyribonucleic acid): 脱氧核糖核酸。 Taq(Thermus aquaticus):水生栖热菌。 dNTP(deoxyribonucleoside triphosphate):脱氧核苷酸三磷酸。 4 材料和设备 4.1 无菌剪刀、镊子。 4.2 电子天平:感量0.01 g。 4.3 无菌均质袋。 4.4 拍击式均质器:400 mL。 4.5 无菌规格板:20 cm2。 4.6 无菌干燥棉拭子。 4.7 微量移液器:量程0.5 μL~20 μL,量程100 μL~1 000 μL,量程1 mL~10 mL。 4.8 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。 4.9 接种环。 4.10 长波紫外光灯:365 nm,功率≤6 W。 4.11 全自动微生物生化鉴定系统。 4.12 载玻片。 4.13 灭菌离心管:1.5 mL。 4.14 PCR反应管。 4.15 高速冷冻离心机:2 000 r/min~13 000 r/min。 4.16 荧光PCR仪。 5 培养基和试剂 除有特殊说明,所有实验用试剂均为分析纯;分子检测实验用水符合GB/T 6682中一级水的要求。 5.1 改良胰蛋白胨大豆肉汤(mTSB):符合附录A中A.2。 5.2 改良山梨醇麦康凯(CT-SMAC)琼脂:符合附录A中A.3。 5.3 营养琼脂:符合附录A中A.4。 5.4 吲哚培养基:符合附录A中A.5。 5.5 柯凡克试剂:符合附录A中A.6。 5.6 MR-VP培养基:符合附录A中A.7。 5.7 甲基红试剂:符合附录A中A.8。 5.8 V-P甲、乙液:符合附录A中A.9。 5.9 西蒙氏柠檬酸盐培养基:符合附录A中A.10。 5.10 月桂基硫酸盐胰蛋白胨-MUG(LST-MUG):符合附录A中A.11。 5.11 山梨醇发酵管:符合附录A中A.12。 5.12 生化鉴定试剂盒。 2SN/T4656.9—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 5.13 肠出血性大肠杆菌O157和H7诊断血清。 5.14 灭菌双蒸水。 5.15 DNA提取液:20 mmol/ L Tris-HCl, 2 mmol/ L EDTA,1.2% Triton X-100(pH 8.0),也可使 用商业化的DNA提取试剂盒。 5.16 10×PCR缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl(pH8.4),200 mmol/L氯化钾,15 mmol/L氯化镁。 5.17 dNTP混合液(10 mmol/ L):每种核苷酸浓度10 mmol/L。 5.18 引物和探针:引物和探针序列符合附录B。 5.19 Taq DNA聚合酶(5U/μL)。 5.20 标准菌株:大肠杆菌标准菌株(CICC10389或等效标准菌株),肠出血性大肠杆菌O157:H7标准 菌株(CICC21530或等效标准菌株)。 6 样品制备 6.1 样品制备方法 6.1.1 称量法 无菌方法打开送检样品,用无菌剪刀(4.1)均匀剪样,在电子天平(4.2)上准确称取剪下的样品 25 g,剪碎后加入到盛有225 mL mTSB(5.1)的无菌均质袋(4.3)中,用拍击式均质器(4.4)拍打 1 min~2 min,充分混匀。 6.1.2 多点采样洗脱法 无菌方法打开送检样品,在样品四周和中间均匀布控5个采样点,用无菌规格板(4.5)比照每个采 样点按4 cm×5 cm(20 cm2)面积范围剪裁,每20 cm2采样面积为1份检样,每件样品共采集5份检样, 采样面积为100 cm2。将上述采集好的5份检样放入盛有200 mL mTSB(5.1)的无菌均质袋(4.3)中, 用拍击式均质器(4.4)拍打1 min~2 min,充分混匀,得到一个样品洗脱液。 6.1.3 棉拭子涂抹法 无菌方法打开送检样品,用mTSB(5.1)湿润无菌干燥棉拭子(4.6),在样品四周和中间均匀布控 5个采样点,用无菌规格板(4.5)比照按每个采样点20 cm2面积范围均匀涂抹,每个采样点用1个无菌 干燥棉拭子(4.6),在4 cm×5 cm(20 cm2)面积范围均匀涂抹,立即用无菌剪刀(4.1)剪去棉拭子手接 触部分,将涂抹部分一起放入盛有50 mL mTSB(5.1)的无菌均质袋(4.3)中混匀。 6.2 样品制备方法选择原则 6.2.1 样品制备一般依6.1.1方法为基准方法; 6.2.2 当样品为面积较大或较厚实或多孔时,样品制备应采用6.1.2方法。采用6.1.2方法时如果被 检样品面积过大或过小,采样点可按比例增加或减少。 6.2.3 当样品质地致密不容易剪碎制备;或样品较贵重,客户要求无损检测的,样品制备应采用6.1.3 方法。 6.2.4 采用6.1.1、6.1.2方法时如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样品匀液转种时,稀释液 可适当增加直至足够吸出转种。 3SN/T4656.9—2023̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 7 方法一 肠出血性大肠杆菌 O1 5 7:H7传统检验方法 7.1 原理 利用肠出血性大肠杆菌 O 1 5 7:H 7不能发酵或迟缓发酵山梨醇的特性 ,接种含山梨醇的 C T - SMAC 琼脂平板进行初筛分离 ;利用肠出血性大肠杆菌 O 1 5 7:H 7不能分解 4 -甲基伞形酮 -β- D -