ICS67.050 CCS X04 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4545.3—2022 商品化试剂盒检测方法 沙门氏菌 方法三 Commercial kit test method—Salmonella—Test method Ⅲ 2022-03-14发布 2022-10-01实施 中华人民共和国海关总署发布 以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件是SN/T 4545《商品化试剂盒检测方法 沙门氏菌》的第3部分。SN/T 4545已经发布了 下列部分: ———商品化试剂盒检测方法 沙门氏菌 方法一; ———商品化试剂盒检测方法 沙门氏菌 方法二; ———商品化试剂盒检测方法 沙门氏菌 方法三。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国福州海关、中华人民共和国长春海关。 本文件主要起草人:郑晶、林杰、郭菁、肖颖、徐珊、陈练洪、陈彬、柯璐、柯秋璇、刘阳、丁旭、王玮琳、 张温玲、黄常娇、曾维扬。 ⅠSN/T4545.3—2022 以正式出版文本为准以正式出版文本为准商品化试剂盒检测方法 沙门氏菌 方法三 1 范围 本文件规定了食品中3M沙门氏菌分子检测试剂盒的检测方法。 本文件适用于食品中沙门氏菌的筛选检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB 4789.4 食品安全国家标准 沙门氏菌检验 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 SN/T 2775 商品化食品检测试剂盒评价方法 SN/T 3266 食品微生物检验方法确认技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全并防止污染,应由具备资格的人员进行操作。所有培养物、DNA提取 物和废弃物应按照GB 19489和GB/T 27403中的有关规定执行。 5 方法提要 根据沙门氏菌属特有靶序列上的6个独立区域,通过稳定的 Bst DNA聚合酶在60 ℃进行环介导 恒温扩增反应,ATP-硫酸化酶将焦磷酸盐(PPi)指数级转化为三磷酸腺苷(ATP),荧光素酶利用ATP 生成光,进行实时检测。 6 试剂和材料 6.1 3M沙门氏菌分子检测试剂盒(3M Molecular Detection Assay2-Salmonella) 参考SN/T 2775和SN/T 3266对3M 沙门氏菌分子检测试剂盒进行了评价。具体评价结果参见 附录A。试剂盒组成如下: 1SN/T4545.3—2022 以正式出版文本为准a) 3MTM裂解液管; b) 3MTM沙门氏菌试剂管; c) 3MTM试剂对照(RC); d) 附加盖。 储存于2 ℃~8 ℃,有效期24个月。 6.2 缓冲蛋白胨水(BPW) 按照附录B.1配制。 7 仪器和设备 7.1 3M分子检测分析仪:含快速转移托盘。 7.2 移液器:量程10 μL~100 μL。 7.3 水浴锅或加热模块: 100 ℃±1 ℃。 7.4 计时器。 7.5 恒温培养箱: 36 ℃±1 ℃。 7.6 电子天平: 感量 为0.1 g。 8 检测程序 3M沙门氏菌分子检测试剂盒的检测程序见图1。 图1 3M沙门氏菌分子检测试剂盒的检测程序 2SN/T4545.3—2022 以正式出版文本为准9 操作步骤 9.1 样品制备、增菌培养 按照GB 4789.4标准方法进行样品制备和缓冲蛋白胨水增菌培养。 9.2 裂解 9.2.1 将裂解液管放置室温(20 ℃~25 ℃), 16 h~18 h进行回温。 9.2.2 打开裂解液管管盖,吸取20 μL 缓冲蛋白胨水增菌液至裂解液管,100 ℃ ±1 ℃加热15 min , 室温(20 ℃~25 ℃)冷却5 min~10 min,获得溶菌液。 9.3 环介导恒温核酸扩增 9.3.1 空白对照、阳性对照设置 每次反应必须设置空白对照和阳性对照,空白对照以缓冲蛋白胨水替代DNA模板,阳性对照使用 试剂盒中的3MTM试剂对照。 9.3.2 反应过程 反应过程操作步骤如下: a) 打开3MTM沙门氏菌试剂管管盖; b) 吸取裂解液管液体上部1/2中的20 μL 溶菌液至3MTM沙门氏菌试剂管中(含有冻干的试剂 小球),盖上附加盖; c) 将3MTM沙门氏菌试剂管装进快速转移托盘,关闭并锁定托盘盖; d) 在3M分子检测分析软件中查看和确认对应的检测,在软件中单击启动按钮,仪器盖自动 打开; e) 将快速转移托盘放入3M分子检测分析仪并关闭盖,启动分析; f) 扩增60 min,仪器实时自动报告检测结果。 10 结果报告 10.1 空白对照结果为阴性,3MTM试剂对照结果为阳性时,结果有效: a) 若仪器报告阳性结果,则该样品沙门氏菌初筛阳性,须取样品增菌液按GB 4789.4进行分离、 生化试验和血清学鉴定后报告结果; b) 若仪器报告阴性结果,则可报告沙门氏菌未检出。 10.2 若空白对照结果为阳性或3MTM试剂对照结果为阴性,则本次检测结果无效,应更换试剂按本方 法重新检测。 3SN/T4545.3—2022 以正式出版文本为准附 录 A (资料性) 3M沙门氏菌分子检测试剂盒评价结果1) A.1 包容性和排他性 选择100株经确认的沙门氏菌标准菌株和分离菌株,用3M沙门氏菌分子试剂盒方法进行测试,结 果全部为阳性。 选择30株经确认的非沙门氏菌的标准菌株,用3M沙门氏菌分子试剂盒方法进行测试,结果全部 为阴性。 A.2 灵敏度、特异性、准确度及检出限 选择5个食品种类,15个食品类型的样品,采用人工污染的方式制备试验样品。分别用3M 沙门 氏菌分子试剂盒方法与参考方法进行测试,相对准确度、相对灵敏度、相对特异性及相对检出限见 表A.1。 表A.1 相对准确度、相对灵敏度、相对特异性和相对检出限 食品基质 相对准确度/% 相对灵敏度/% 相对特异性/%相对检出限/(CFU/g) 肉类 100 100 100 0.16 鱼类和海产品 100 100 100 0.16 果蔬制品 100 100 100 0.24 乳制品 100 100 100 0.24 杂品 100 100 100 0.28 A.3 耐变性 分别对3个实验条件进行耐变性试验:裂解时间(13 min,17 min),裂解体积(18 μL,22 μL)和反应 体积(18 μL,22 μL)。试验结果表明3M沙门氏菌分子检测试剂盒在各实验条件波动范围内,对检测结 果无显著性影响。 A.4 批间变异 取3个不同批号试剂盒分别对含目标菌和非目标菌样品进行批间变异试验,试验结果表明,3M 沙 门氏菌分子检测试剂盒批间无显著性差异。 1) 本评价结果仅适用于3M有限公司的沙门氏菌分子检测试剂盒。 4SN/T4545.3—2022 以正式出版文本为准