以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2865 —2024 代替 SN/T 2865 —2011 尼帕病毒病检疫技术规范 Quarantine protocol for Nipah virus disease 2024 -12-16发布 2025 -06-01 实施ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国海关总署 发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 2865—2024I前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 则起草。 本文件代替 SN/T 2865— 2011《尼帕病毒病检疫技术规范》 ，与 SN/T 2865— 2011 相比，主要技术 变化如下： ——删除了电镜观察； ——增加了生物安全要求（见第 5 章） ； ——增加了反转录聚合酶链式反应（见第 11 章） ，采用世界动物卫生组织（WOAH） 《陆生动物 诊断试验和疫苗手册》 （2022 版）3.1.15 ； ——增加了实时反转录聚合酶链式反应（见第 12 章） ，采用 WOAH《陆生动物诊断试验和疫苗 手册》 （2022 版）3.1.15 ； ——增加了数字反转录聚合酶链式反应（见第 13 章） ； 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国青岛海关、中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国上海 海关、中华人民共和国南京海关、中华人民共和国深圳海关、中华人民共和国大连海关。 本文件主要起草人：王群、郑小龙、朱来华、王艳、帅江冰、李健、岳志芹、姜焱、姜帆、龙 云凤、马萍萍、薛俊欣、秦智锋、张晓峰、贾赟。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为： —— 2011 年首次发布为 SN/T 2865— 2011 ； ——本次为第一次修订。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准1 SN/T 2865—2024尼帕病毒病检疫技术规范 1 范围 本文件描述了动物尼帕病毒病的临床诊断、病毒分离鉴定、免疫组织化学试验、微量血清中和 试验、酶联免疫吸附试验、反转录聚合酶链式反应、实时反转录聚合酶链式反应、数字反转录聚合酶 链式反应等检疫方法。 本文件适用于进出境动物尼帕病毒病的检疫。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 SN/T 2984 检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CPE ：细胞病变（ Cytopathic Effect） NiV ：尼帕病毒（Nipah Virus） TCID50：半数组织培养感染剂量 PC ：过程质控（ Process Control） 5 生物安全 尼帕病毒病是一种人兽共患病，实验室生物安全应符合 GB 19489 的规定。应按照 SN/T 2984 的 规定操作相应的试验材料，病毒分离培养及动物感染实验必须在 BSL-4 实验室内进行，未经培养的 感染材料的操作在 BSL-3 实验室内进行，而灭活的材料的操作可在 BSL-2 实验室内进行。 以正式出版文本为准2 SN/T 2865—20246 临床诊断 6.1 流行病学 尼帕病毒病是一种人兽共患传染病，能够感染人、猪等多种动物，在猪群内传播迅速，症状却 不明显，在人群中有人传人的可能，并且人感染 NiV 之后，死亡率高达 40%~70%。 6.2 临床症状 NiV 可以感染各个年龄段的猪，不同类别的猪表现出不同的临床症状，母猪首先表现为神经症 状，肉用猪表现为呼吸道症状，圈养的母猪和公猪活动受到限制，可能掩盖其呼吸道症状。 猫、狗和马也可以感染，以呼吸道症状为主。狗感染后，出现类似犬瘟热症状；马感染后，出现 神经症状。 6.3 病理变化 NiV 感染猪没有特征性病变，肺和脑膜是主要的病变器官。大多数病例表现由轻微到严重的肺部 病变，包括程度不同的实变、气肿、淤血性溢血以及呼吸道有带血丝的分泌物，切开肺部，可见肺小 叶间隔肿胀。脑膜弥漫性充血、水肿，其他的内脏器官没有明显变化。 6.4 临床判定 当易感动物出现以上 6.2 中的相关临床症状，并符合 6.1 的流行病学特征，可怀疑尼帕病毒感染， 确诊需进一步采样进行实验室诊断。 7 病毒分离鉴定 7.1 主要试剂 7.1.1 Vero 细胞或 RK-13 细胞。 7.1.2 EMEM 或其他培养基。 7.1.3 抗生素贮存液（见附录 A.1） 。 7.1.4 细胞消化液（见附录 A.2） 。 7.1.5 细胞培养液（见附录 A.3） 。 7.1.6 细胞维持液（见附录 A.3） 。 7.2 仪器设备 7.2.1 生物安全柜。 7.2.2 倒置显微镜。 7.2.3 高速冷冻离心机：最大离心力 12 000 g 以上。 7.2.4 二氧化碳培养箱。 7.2.5 高压灭菌锅。 7.3 样品采集与处理 7.3.1 样品采集与运送 : 无菌采集动物脑、肺、肾和脾脏等组织，4 ℃保存运送到 BSL-4 级生物安全 实验室，也可用干冰保存运送，但病料不能长期存放在 -20 ℃。样品包装运输可参考国务院《病原微 生物实验室生物安全管理条例》以及国际民航组织《危险品航空安全运输技术细则》的要求。 以正式出版文本为准3 SN/T 2865—20247.3.2 样品处理 : 无菌处理样品，样品称量，按照 1 ：10 加入含有组织培养液（含青霉素 100 IU/mL 和链霉素 100 µg/mL） ，使用封闭的组织研磨器，制备成 10 % 组织悬液。以 1 500 r/min 离心 10 min， 小心收取上清液低温保存备用。 7.4 病毒分离 7.4.1 将上述上清液用维持液作倍比稀释，无菌接种于已长成单层的 Vero 或 RK-13 细胞瓶或细胞培 养板上，每个滴度接种两瓶或两孔。 同时设立细胞对照和阳性对照，单层细胞仅加维持液做细胞对照， 用稀释的标准病毒接种做阳性对照。 7.4.2 加盖摇匀使之均匀分布于整个细胞层，置 5 % 二氧化碳培养箱于 37 ℃孵育 1 h，然后加入维 持液继续培养，逐日观察 CPE，尼帕病毒一般在 3 d 内出现 CPE。 7.4.3 无 CPE 出现者应盲传两代，即将细胞培养物冻融两次，再接种到单层细胞培养 5 d ~7 d，出 现 CPE 者，待 70 % 细胞出现 CPE 时，收取细胞毒。将感染细胞反复冻融数次，2 000 r/min 离心 10 min，小心收集上清液，分装后低温保存，待进一步进行病毒鉴定。 7.4.4 用微量血清中和试验或其他方法对分离的病毒进行鉴定。 7.5 结果判定 检查各种对照试验，细胞对照正常，无 CPE，阳性对照出现明显的 CPE，说明试验成立。如果 试验组出现明显的 CPE，表现为细胞圆缩、脱落、裂解，则初步判定为病毒分离阳性。 8 免疫组织化学试验 8.1 原理 免疫组化法用于检测福尔马林固定的组织或细胞，该方法还可以检测存放已久的病料，用于调 查以往该病发生的情况，在发病动物的很多组织中都可以检测到该病毒，病料采集范围包括：不同的 脑组织、脾脏、肾脏和纵隔淋巴结等。孕畜还应包括子官、胎盘和胎儿的器官等。 8.2 主要试剂 8.2.1 固定液（见附录 B.1） 。 8.2.2 石蜡。 8.2.3 二甲苯。 8.2.4 无水乙醇。 8.2.5 胰蛋白酶。 8.2.6 脱脂奶粉。 8.2.7 兔抗尼帕病毒抗体。 8.2.8 羊抗兔酶标二抗。 8.2.9 显色液（见附录 B.2） 。 8.2.10 Scott’s 溶液（见附录 B.3） 。 8.2.11 H2O2。 8.2.12 中性封片剂。 8.3 仪器设备 8.3.1 石蜡切片机。 8.3.2 正置显微镜。 以正式出版文本为准4 SN/T 2865—20248.3.3 水平摇床。 8.4 病料处理 8.4.1 将采集的病料选取具有典型病变 0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm 大小的组织，浸入 10 倍体积固定液 固定，7 d 后更换固定液，再维持一周。 8.4.2 将选取好的组织块放入新配的固定液中固定 7 d，其间更换固定液三次，并在水平摇床上不断 摇荡，以提高固定液的渗透力。 8.4.3 将固定好的组织块放入流水中漂洗 24 h。 8.4.4 放入下列不同浓度的酒精中脱水： 75% 酒精 2 h → 85% 酒精 2 h → 95% 酒精Ⅰ 2 h → 95% 酒精Ⅱ 2 h → 100% 酒精Ⅰ 2 h → 100% 酒精Ⅱ 2 h。 8.4.5 放入二甲苯中透明： 二甲苯Ⅰ 10 min →二甲苯Ⅱ 30 min。 8.4.6 浸蜡：软蜡中放置 2 h ；硬蜡中放置 4 h。 8.4.7 将浸好蜡的组织块放入包埋框中用硬蜡包埋，4 ℃冷却过夜。 8.4.8 将石蜡块切成 5 µm 厚的切片，用干净的载玻片贴片。 8.5 操作方法 8.5.1 脱蜡：依次将切片放入二甲苯 - 二甲苯 - 二甲苯各 1 min，无水乙醇