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̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э I C S6 5.0 2 0.2 0 C C SB1 6 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/T2 7 5 7—2 0 2 2 代替S N/T 2 7 5 7—2 0 1 1 植物线虫检测规范 R u l e s f o r d e t e c t i o n o f pl a n t pa r a s i t i c n e m a t o d e s 2 0 2 2-0 7-0 7发布 2 0 2 3-0 2-0 1实施 中华人民共和国海关总署 发 布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照 G B/T 1. 1—2 0 2 0《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 本文件代替 S N/T 2 7 5 7—2 0 1 1《植物线虫检测规范 》 ,与S N/T 2 7 5 7—2 0 1 1相比,除结构调整和编 辑性改动外 ,主要技术变化如下 : — — —增加了术语和定义 、现场取样章节 ; — — —对第7章进行了丰富 ,增加了各环节的要点和注意事项 ; — — —删除了原文件附录 A中的线虫分离方法 、附录C中的常用培养方法和附录 D中的线虫常用溶 液; — — —在附录A中增补了 D e m a n公式、线虫学描述常用语和通用线虫分子鉴定方法 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 :中国海关科学技术研究中心 、中华人民共和国宁波海关 、中华人民共和国天津海 关、中华人民共和国广州海关 、中华人民共和国昆明海关 、中华人民共和国北京海关 、中华人民共和国青 岛海关、中华人民共和国黄埔海关 。 本文件主要起草人 :边勇、顾建锋、王金成、赵立荣、杜宇、刘若思、刘乐乐、皋司虎、封立平、曹志玲。 本文件于 2 0 1 1年发布为 S N/T 2 7 5 7—2 0 1 1,本次为第一次修订 。 ⅠS N/T2 7 5 7—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 植物线虫检测规范 1 范围 本文件规定了进出境植物线虫的检测规范 。 本文件适用于进出境植物及植物产品 、媒介昆虫 、土壤及栽培介质中线虫的检疫鉴定 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本 (包括所有的修改单 )适用于 本文件。 G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 G B/T 2 7 4 0 2 实验室质量控制规范 植物检疫 S N/T 1 8 4 8 植物有害生物鉴定规范 S N/T 2 1 2 2 进出境植物及植物产品检疫抽样 S N/T 1 7 2 4 进境针叶树原木 、木制品和木质包装材料中松材线虫的检疫操作规程 S N/T 4 6 4 3 线虫标本采集分离保存规范 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 D e M a n公式 D e M a n’s f o r m u l a D e M a n (1 8 8 0)提出的一套用系列字母代表的线虫形态测量值或测量比值 ,适用于线虫形态的 描述。 3.2 植物线虫 pl a n t n e m a t o d e 能够侵染植物 ,引起植物病害 ,造成产量损失或植物产品质量变劣的线虫类群 。 注: 通常被称为植物寄生线虫或植物病原线虫 ,简称植物线虫 。 3.3 媒介昆虫 v e c t o r i n s e c t 所有能够携带 、传播植物病原线虫的昆虫 。 注: 常 见 的 线 虫 媒 介 昆 虫 有 吉 丁 虫 科 B upr e s t i d a e ,象 甲 科 C u r c u l i o n i d a e ,小 蠹 科 S c o lyt i d a e和 天 牛 科 C e r a m byc i d a e等。 4 原理 植物线虫可随植物及植物产品 、媒介昆虫 、土壤及栽培介质等作远距离传播 。线虫检测工作的一般 原理是利用线虫的自主活动性 、趋水性、密度、体型大小等特点 ,使用直接解剖法 、改良漏斗法 、密度离心 1S N/T2 7 5 7—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 法、漂浮法等将其从寄主植物 、土壤或栽培介质 、包装材料等中分离出来 ,然后以形态学方法为主 ,辅以 D e M a n测计值,结合分子生物学 、生态学、生物学、生物化学 、细胞学等方法 ,综合判定其分类地位 — — — 科、属、种及亚分类单元的一项工作 。 5 仪器设备 、器具和主要试剂 5.1 仪器设备 体视显微镜 (具透射光源和落射光源 ) 、生物显微镜 、冷藏冰箱 、超低温冰箱 、离心机、P C R仪、电泳 仪、凝胶成像系统 、高压灭菌锅 、烘箱、加热板、水浴锅、离心机等 。 5.2 器具 自封袋、表面皿或培养皿 、载玻片、盖玻片、凹玻片、网筛(1 0 目、2 0 目、5 0 目、8 0 目、1 2 0目、3 6 0 目、 5 0 0 目) 、烧杯、漏斗、漏斗架、浅盘、乳胶管或硅胶管 、止水夹、小镊子、斧头、剪刀、医用解剖刀 、线虫滤纸 或面巾纸 、酒精灯、干燥器、试管、线虫挑针 、记号笔、毛刷、毛笔、玻璃纤维丝 、P C R管、可调式微量移液 器(2 μL~1 0 0 0 μL)及相应的吸头等 。 5.3 主要试剂 实验用试剂一般应为分析纯 ,实验用水应符合 G B/T 6 6 8 2 相关规定 。主要试剂包括 :福尔马林 (4%甲醛) 、指甲油、阿拉伯树胶 、凡士林、纯甘油、无水乙醇 、石蜡、蔗糖、核酸胶染料 (G e l R e d) 、P C R反 应所需引物 、2×T aq M a s t e r M i x 预混液、蛋白酶K(2 0 mg/mL) 、T aq DNA聚合酶、D L 2 0 0 0 M a r k e r、 冰乙酸(C2H4O2) 、 三羟甲基氨基甲烷 (T r i s) 、乙二胺四乙酸二钠 (N a2E DTA•2H 2O) 、无RN a s e无菌 水和灭菌双蒸水等 。 6 现场检疫与取样 6.1 现场检疫 按照S N/T 2 1 2 2 的方法进行现场检疫和抽样 。重点检查是否有线虫危害症状 ,应注意线虫为害早 期通常无明显症状 ,侵染后期症状逐步出现 ,具体症状与植物种类 、可能携带线虫种类 、侵害程度 、为害 部位等有关 ,除6. 2所述常见症状外 ,还可针对不同种类 ,参考相关文献资料予以掌握 。 6.2 症状检查 6.2.1 植物的检查 地上部分有无生长不良 ,植株矮化 、叶色失绿 、黄化、坏死、萎蔫,叶、茎或其他组织是否坏死 、肿大、 畸形等;植物材料横切面有无腐烂 、变色。茎、叶、花、芽、果实等线虫可能寄生的部位均应仔细检查 ,看 是否有线虫为害症状 。 地下部分有无根系腐烂变黑 ,须根是否增生 ,根部有无斑点 、斑痕等。根部特别要注意根茎 、块茎、 球茎等部位有无根结 、瘿瘤,有无黄色 、褐色或白色针头大小的颗粒状物 ,茎杆中部是否有孔形 、环形、点 状腐烂,块根、块茎是否干缩龟裂和腐烂等 。 6.2.2 种子的检查 肉眼和手持放大镜仔细检查种子 ,拣出畸形 、变色、虫瘿、干秕种子等有为害症状的可疑种子 ,并收 集其中夹带的介质或土壤等杂质 ,分别用塑料袋装好 ,加贴标识 ,带回实验室检测 。 2S N/T2 7 5 7—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 6.2.3 其他材料的检查 植物、植物材料和植物产品等是否夹带土壤或其他栽培介质等 ;木质部是否有蓝变 ,有无媒介昆虫 栖居的痕迹 ,如侵入孔 、蛀道、蛹室等;纵切植株组织是否有虫蛀隧道及媒介昆虫幼虫与成虫等 。如有, 收集相关样品 ,带回实验室检测 。 6.3 取样 检查时发现明显症状的情况下 ,应有针对性地抽取具有可疑症状的样品及邻近样品 ;对于无可疑症 状的样品则按要求随机抽样 ;对于根部包裹有栽培介质的植物 ,应以主根为中心进行取样 。采集的样品 分别用塑料袋装好 ,加贴标识 ,并尽快送实验室检测 。 7 实验室检测 7.1 样品接收 样品传递过程中应避免在高温环境下时间过久 。实验室收到样品后 ,如不能立即对样品实施检测 , 应将样品置于 4 ℃~1 0 ℃冷藏冰箱进行短期保存 ,注意保湿 、透气、避光,并尽快实施检测 。 7.2 样品的前处理 7.2.1 植物组织 将植物材料 (根、茎、叶、果实及种子 )切成小段或薄片 (厚度<0. 5 c m) ,或将种子等较小的植物材 料撕开,待测。在进行植物组织样品前处理过程中 ,可同时对切开的植物组织进行症状检查 ,察看是否 存在线虫侵害状 ,如组织穿孔 、腐烂等。 7.2.2 土壤及栽培介质 将从植物材料和运输工具上收集到的土壤或介质混匀 ,取1 0 0 m L以上作为待测样品 。不足1 0 0 m L 则全部检测 。 7.2.3 媒介昆虫 将媒介昆虫或部分虫体放入小钵里研碎 ,加水浸泡数小时后直接镜检 。 7.2.4 原木、木制品和木质包装材料 将原木、木制品和木质包装材料劈成薄片 (厚度<0. 5 c m)作为待测样品 。具体可参照 S N/T 1 7 2 4。 7.3 线虫分离 线虫分离是线虫检测的关键步骤之一 。首先应考虑如何更有效地获得目标线虫 ,根据线虫的寄生 部位、体型大小等因素不同 ,在进行线虫分离时 ,应选择一种或多种方法进行线虫分离

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