̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э I C S 6 5.0 2 0.2 0 C C S B 1 6 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/T2 6 1 7—2 0 2 2 冬生疫霉病菌检疫鉴定方法 D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f P hyt oph t h o r a h i b e r n a l i s C a r n e 2 0 2 2-0 7-0 7发布 2 0 2 3-0 2-0 1实施 中华人民共和国海关总署 发 布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1 部分:标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国南宁海关、 中华人民共和国天津海关。 本文件主要起草人:吴品珊、雷荣、焦彬彬、闫正跃、罗加凤、杨翠云。 ⅠSN/T2617—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 冬生疫霉病菌检疫鉴定方法 1 范围 本文件描述了植物检疫中冬生疫霉病菌Phytophthora hibernalis Carne的检疫鉴定方法。 本文件适用于针对冬生疫霉寄主的植株和果实以及夹带土壤的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 病原菌基本信息 学名:Phytophthora hibernalis Carne 分类地位:真核生物域(Eukaryota Domain),菌藻界(Chromista),卵菌门(Oomycota),霜霉纲 (Peronosporea),霜霉目(Peronosporales),霜霉科(Peronosporaceae),疫霉属(Phytophthora)。 传播途径:主要通过感病寄主、土壤和水流传播扩散。短距离传播为孢子囊借助灌溉、溅射的水、风 雨或蜗牛传播,贸易性调运寄主苗木、果实是病菌远距离传播的主要方式。 寄主范围:主要为柑橘属植物,还可侵染杜鹃等植物。 病菌的其他信息参见附录A。 5 方法原理 依据病害症状、分离菌的形态特征和分子生物学特性,用常规PCR或荧光PCR特异性引物扩增冬 生疫霉病菌的ITS(internal transcribed spacer)基因,或用重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)特异性引物扩增ras-related Yptl基因,对冬生疫霉病菌进行综合检疫鉴定。 6 仪器和用具 6.1 仪器 生物显微镜、体视显微镜、纯水仪、光照培养箱、高压灭菌锅、超净工作台、制冰机、PCR仪、实时荧 光PCR仪、恒温扩增仪、凝胶成像系统、电泳仪、电子天平(感量0.01 g)、冰箱。 6.2 用具 烧杯、三角瓶、量筒、试管、培养皿、酒精灯、镊子、剪刀、解剖刀、载玻片、盖玻片、塑料研杵、移液器、 移液器吸头、离心管、液氮罐、封口膜parafilm、基于链霉亲和素和荧光素的核酸检测试纸条。 1SN/T2617—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 7 试剂、材料和培养基 7.1 试剂 琼脂粉、V8液、碳酸钙、葡萄糖、琼脂糖、次氯酸钠溶液、匹马霉素、氨苄青霉素钠盐、利福平钠盐、 五氯硝基苯、Tween 20、氯化钙、Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)缓冲液、氧化镁、280 mmol/L醋 酸镁溶液、TwistAmp􀆿nfo酶干粉、PBST (含0.1% Tween 20的磷酸缓冲液)、盐酸、乙二胺四乙酸四 钠盐(Na2EDTA)、十二烷基硫酸钠、氢氧化钠、醋酸钠、氯化钾、50×TAE(Tris-醋酸盐-EDTA)、无菌双 蒸水、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液、Tris饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、 RNase A、液氮、苯酚、三氧甲烷、蛋白酶K、Taq DNA聚合酶、Taq Man PCR Master Mix、PCR反应缓 冲液、核酸染料、dNTP、DNA分子质量标准物。 7.2 材料 马铃薯、雪松松针、柑橘叶片、冬生疫霉病菌DNA。 7.3 培养基 PARP-V8选择性培养基、V8培养基、马铃薯葡萄糖培养基具体配方参见附录B。 8 检疫鉴定方法 8.1 症状检查 观察柑橘等寄主果实是否有变褐色,叶片和小枝是否枯萎;杜鹃属等寄主植物叶片、根茎是否有病 斑;其他寄主上为根部腐烂或溃疡。症状图片见附录A。 检查寄主是否携带土壤或介质,收集土壤或介质做诱集试验。 8.2 分离培养和诱集 8.2.1 分离培养 将疑似症状的柑橘果实表皮、植物根茎叶等其他组织,用0.5%次氯酸钠消毒2 min~5 min,无菌 水冲洗3次,灭菌滤纸吸干水分,放于PARP-V8选择性培养基或马铃薯葡萄糖培养基上。 16 ℃~20 ℃黑暗培养4 d~6 d,如有真菌菌落出现,转到V8培养基上,16 ℃~20 ℃黑暗培养。 8.2.2 土壤和介质诱集 称取25 g土壤或介质,碾碎去杂放入灭菌烧杯中,加入无菌水将材料润湿,封口后置于16 ℃~ 20 ℃黑暗放置。 3 d~5 d后在烧杯中加入灭菌水,使水层高4.0 cm。取雪松松针或柑橘叶片,无菌水清洗后漂放 在水面或浸在水中,16 ℃~20 ℃黑暗诱集。 2 d~3 d后开始检查,取有失绿或变色的雪松松针或柑橘叶片,无菌水冲洗,灭菌滤纸吸干水分,放 于PARP-V8选择性培养基或马铃薯葡萄糖培养基上,如有真菌菌落出现,转至V8培养基上16 ℃~ 20 ℃黑暗培养纯化。 8.2.3 孢子囊培养 切取纯化菌落边缘菌丝块置于灭菌培养皿中,加无菌水至菌块表面有游离水,16 ℃~20 ℃黑暗培 2SN/T2617—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 养诱发孢子囊,1 d~2 d后观察孢子囊生成。 8.2.4 卵孢子培养 将分离菌转到V8培养基上,在7 ℃~8 ℃黑暗培养4周~6周,观察是否有卵孢子形成。 8.3 分子生物学鉴定 8.3.1 DNA提取 收集分离出的疑似真菌,放入1.5 mL离心管中,浸在液氮里用塑料研杵碾碎,采用CTAB法或植 物基因组提取试剂盒提取DNA。 DNA提取方法按附录C执行。 8.3.2 常规PCR检测 特异性引物PHIB1和PHIB2的序列分别为5'-TCGGGTCTGAGCTAGTAGTCTT-3'、5'-CTTC- CACAACCAATTCCATTATGC-3'。 反应体系(25 μL):样品DNA 2 μL,10×PCR buffer 2.5 μL,2.5 mmol/L MgCL2 2.5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL,10 μmol/L 引物各0.5 μL,5 U/μl Taq DNA polymerase 0.2 μL,ddH2O 14. 3 μL。 反应条件:94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s、64 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s,30个循环;72 ℃ 10 min,4 ℃保存。 以冬生疫霉病菌的DNA作为阳性对照,以无菌水作为空白对照,以健康寄主植物DNA作为阴性 对照。 扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶(含荧光染料)、1×TAE 缓冲液进行电泳分离,用凝胶成像系统 分析。 8.3.3 实时荧光PCR检测 特异性引物PH-F的序列为5'-CGACTTGCCACCGGGA-3'、PH-R的序列为5'-AACGGTACT- TCTCTTTGCTCGAA-3'、荧光探针PH-Pr的序列为5'-(FAM) TTCCACAACCAATTCCAT (NFQ- MGB)-3'。 反应体系(25 μL):样品DNA 1 μL,2×Taq Man PCR Master Mix 12.5 μL,10 μmol/L特异性引 物各1 μL,10 μmol/L 探针PH-Pr 0.5 μL,ddH2O 9.0 μL。 反应条件:94 ℃ 10 min;94 ℃ 15 s、56 ℃ 60 s,40个循环。 以冬生疫霉病菌的DNA作为阳性对照,以无菌水作为空白对照,以健康寄主植物DNA作为阴性 对照。 8.3.4 RPA试纸条法 特异性正向引物PhRPA-F的序列为5'-TTCCACCCTTCCACCAGACTGCTGAGGAGG-3'、反向 引物PhRPA-R的序列为5'-(Biotin)TGTTAGCTGCGTGTTCGTTGGTCACCCCAGA-3'、探针PhR- PA-P的序列为5'- (FAM)CTTCTGTGATTTATCCAGAAAATCCGTACGAT-THF-GAGCTG- GACGGCAAGA(C3 space) -3'。 反应体系(50 μL):将29.5 μL再水化缓冲液、11.2 μL无菌水、2.1 μL 10 μmol/L正向引物、 2.1 μL 10 μmol/L反向引物和0.6 μL 10 μmol/L探针溶液混匀后,加入到TwistAmp􀆿nfo酶干粉 中,充分溶解后,加入2 μL样品DN