̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS65.020.20 CCSB 16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5545—2022 猕猴桃果腐病菌检疫鉴定方法 Detection and Identification of Neofabraea actinidiae 2022-07-07发布 2023-02-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:天津海关动植物与食品检测中心、中华人民共和国上海海关、重庆海关技术中心、 成都海关技术中心。 本文件主要起草人:张莹、罗加凤、刘鹏、胡佳续、廖芳、焦彬彬、滕少娜、邵宝林、张裕君、贺艳。 ⅠSN/T5545—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 猕猴桃果腐病菌检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了猕猴桃果腐病菌的检疫鉴定方法。 本文件适用于猕猴桃果腐病菌相关寄主中猕猴桃果腐病菌的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 基本信息 中文名:猕猴桃果腐病菌 学名:Neofabraea actinidiae 无性态:Cryptosporiopsis actinidiae 英文名:Fruit rots of kiwifruit 分类地位:猕猴桃果腐病菌属真菌界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、盘菌亚门(Pezizomycoti- na)、锤舌菌纲(Leotiomycetes)、柔膜菌目(Helotiales)、皮盘菌科(Dermataceae)、明孢盘菌属(Neofab- raea)。 传播途径:由带菌果实及枝条进行远距离传播。 猕猴桃果腐病菌的其他信息参见附录A和附录B。 5 方法原理 以病原菌的危害症状、分离培养性状、形态学特征、ITS序列特征作为猕猴桃果腐病菌的检疫鉴定 依据。 6 检测流程 猕猴桃果腐病菌检测流程见图1。 1SN/T5545—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 图1 猕猴桃果腐病菌检测流程 7 器材和试剂 7.1 器材 灭菌培养皿 、三角瓶、镊子、手术剪、手术刀、接种刀、脱脂棉、酒精灯。 体式显微镜 、生物显微镜 、超净工作台 、培养箱、电子天平 、高压灭菌锅 、常规冰箱 、P C R扩增仪、电 泳仪、凝胶成像仪 、高速冷冻离心机 、恒温水浴锅 。 7.2 试剂 乙二胺四乙酸 (E DTA) 、十二烷基磺酸钠 (S D S) 、T r i s - HC l 、异戊醇、三氯甲烷 、无水乙醇 、7 0%乙 醇、1%次氯酸钠 、氯化钾、氯化镁、蛋白酶K、引物I T S 4/I T S 5、T aq聚合酶等分子生物学试剂 ,植物组织 及真菌基因组提取试剂盒 。 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (P DA) :马铃薯2 0 0 g、葡萄糖2 0 g、琼脂2 0 g、蒸馏水定容至 1 0 0 0 mL, 1 2 1 ℃高压灭菌 2 0 m i n。 8 鉴定方法 8.1 症状检查 病菌在枝条上潜伏侵染 ,不表现症状 。在果实表面 、蒂部为圆形褐色病斑 (附录A) ,将枝条和可疑 果实样品进行分离培养 。 8.2 分离培养 将枝条剪成小段 ,用1%的次氯酸钠表面消毒 5 m i n,无菌水冲洗 3遍,置于P DA培养基上于 2 0 ℃ 培养。用7 0%乙醇对病果表面消毒 ,挑取病斑处霉层或病健交界处果肉组织 ,置于P DA培养基上于 2 0 ℃培养。长出菌丝后 ,从菌落边缘挑取菌丝移至新的 P DA培养基上纯化 。 2S N/T5 5 4 5—2 0 2 2̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 8.3 形态学观察 观察记录菌落培养性状,包括菌落颜色、形状等,在显微镜下观察分生孢子形状,测量记录30个分 生孢子大小。 8.4 ITS扩增及序列分析 8.4.1 菌丝DNA提取 采用CTAB提取法或基因组提取试剂盒制备DNA,见附录C。 8.4.2 PCR检测 PCR检测方法见附录D。 8.5 致病性测定 必要时(如首次截获等),进行致病性测定。 可选用猕猴桃果腐病菌感病品种绿心猕猴桃(Actinidia deliciosa cv. “Hayward”)和黄金猕猴桃 (A. chinensis “Hort 16A”)的健康果实接种,用70%乙醇对果实表面进行擦拭消毒。采用灭菌针刺出 伤口,挑取适量菌丝,将其接种在伤口上,用湿润的灭菌脱脂棉覆盖伤口,设置无菌水空白对照。将接种 后的果实放入无菌塑料袋中,于20 ℃~22 ℃保湿2 d,室温下继续培养观察,3 d 后出现症状,取发病部 位的病健交界组织进行病原菌再分离。 9 鉴定特征 9.1 培养性状 菌落圆形,边缘整齐,气生菌丝絮状,在菌落中部增厚稍隆起,菌丝浅粉色或白色,培养5 d左右,菌 株在PDA培养基上产生鲜艳的色素,橙红色或鲜红色(附录B)。 9.2 形态特征 猕猴桃果腐病菌的载孢体为枕状分生孢子盘,培养5 d~7 d 后产生。产孢细胞由菌丝直接产生, 或着生于分生孢子梗顶端,分生孢子梗紧密排列在分生孢子盘中或产生于菌丝不规则分枝上。产孢细 胞单胞、无色,圆柱形,顶端渐细,具有较明显的喇叭形产孢痕迹。产孢细胞大小(8.5 μm~14.5 μm)× (3 μm~4 μm)。产孢细胞内壁芽生出大量分生孢子。分生孢子单胞、无色,长椭圆形、椭圆形或卵形, 直或微弯,有或无油球,末端宽圆,基部有明显的着生痕迹。分生孢子大小(5 μm~14 μm)×(3 μm~ 5.5 μm),平均10.2 μm×4.0 μm (附录B)。 9.3 ITS序列比对 经BLAST分析,PCR扩增到的ITS基因序列与NCBI网站GenBank中登录号为NR_155469的 Neofabraea actinidiae序列同源性为99%~100%,则判定为阳性。 9.4 致病性测定的症状表现 接种3 d~5 d 后,猕猴桃开始发病,接种部位出现褐色圆形病斑,病斑凹陷,棕色或暗红色,2 d 后 病斑处有白色稀疏霉层。取发病果实的病健交界处进行分离培养,获得的分离菌与原接种菌形态特征 相同。 3SN/T5545—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 10 结果判定 病原菌培养性状和形态特征符合9.1及9.2中描述,ITS序列比对结果与9.3描述相符,判定检出 猕猴桃果腐病菌,否则判定未检出猕猴桃果腐病菌。 11 菌株保存与处理 分离并最终鉴定为猕猴桃果腐病菌的菌株应转入PDA培养基斜面上,存活后经登记和经手人签 字,置于4 ℃黑暗条件下保存,定期(3个月)转接,以防止病菌死亡,至少保存6个月,以备复验、谈判和 仲裁。必要时用病菌分生孢子作冻干菌种保存。保存期满后高压灭活处理。 4SN/T5545—2022