ICS67.050 CCSX16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1632.4—2022 出口乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌) 检测方法 第4部分:PCR-CRISPR 法 Test method of Cronobacter spp.(Enterobacter sakazakii) in export milk powder—Part 4:PCR-CRISPR method 2022-03-14发布 2022-10-01实施 中华人民共和国海关总署发布 以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020和GB/T 20001.4—2015的规定起草。 本文件是SN/T 1632《出口乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测方法》的第4部分。SN/T 1632 已经发布了以下部分: ———第1部分:分离与计数; ———第2部分:PCR方法; ———第3部分:荧光PCR方法; ———第4部分:PCR-CRISPR法。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国上海海关、上海市质量监督检验技术研究院、深圳大学第一附属 医院、大连民族大学。 本文件主要起草人:杨捷琳、刘洋、张清平、薛俊欣、杨娟、张懿翔、袁辰刚、李林显、蒋原、王金、 郭德华、王越、申进玲、曲勤凤、郑秋月、张奕南、赵磊。 ⅠSN/T1632.4—2022 以正式出版文本为准以正式出版文本为准出口乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌) 检测方法 第4部分:PCR-CRISPR法 1 范围 本文件规定了乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)(Cronobacter spp.)的PCR-CRISPR检测方法。 本文件适用于乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)(Cronobacter spp.)的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅 该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB 4789.40 食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403—2008 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 Cas蛋白 Cas protein Cas蛋白是指CRISPR-associated蛋白,它是CRISPR系统中起功能作用的相关蛋白。 3.1.2 Cas12b酶 Cas12b enzyme Cas蛋白的一种,属于II类V-b型Cas蛋白,是crRNA:tracrRNA(sgRNA)依赖的核酸内切酶。 3.1.3 向导RNA guide RNA 向导RNA是指引导Cas蛋白特异性结合靶标DNA序列的RNA,通常由crRNA或crRNA: tracrRNA(sgRNA)复合物组成。 3.1.4 N值 N value CRISPR方法检测结果的判定值。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CRISPR:成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic re- peats) tracrRNA:反式激活CRISPR RNA(trans-activation CRISPR RNA) 1SN/T1632.4—2022 以正式出版文本为准4 方法提要 本文件通过PCR-CRISPR方法对乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)开展定性检测。首先采用普 通PCR进行克罗诺杆菌属fusA基因特异性扩增,再用CRISPR反应特异性切割扩增产物,观察荧光 值增量并给出结果判定。CRISPR/Cas12b是基因编辑系统中的一种,其对应的tracrRNA和crRNA 通过碱基互补配对方式形成RNA复合结构,该结构与Cas12b结合形成复合物,如果有目标DNA存 在,Cas12b蛋白在crRNA:tracrRNA引导下特异性结合靶标核酸,之后其非特异性切割单链DNA的 活性被激活,从而将体系中单链DNA报告分子切开并释放出可检测的信号。 5 试剂和材料 除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T 6682一级水的要求。所有 试剂均用无DNA/RNA酶污染的容器分装。 5.1 缓冲蛋白胨水(BPW)。 5.2 裂解液:20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02 mol/L EDTA,pH调至8.0。 5.3 TE缓冲液:1 mmol/L Tris-HCl,0.1 mmol/L EDTA,pH8.0。 5.4 蛋白酶K:20 mg/mL。 5.5 Tris饱和酚。 5.6 三氯甲烷。 5.7 异戊醇。 5.8 乙醇。 5.9 2×PCR缓冲液:Phanta􀆿 Max Buffer。 5.10 dNTP 混合液 (10 mM)。 5.11 DNA 聚合酶。 5.12 NEBuffer:100 mM NaCI,50 mM Tris-HCI,10 mM MgCl2,100 ug/ml BSA,pH7.9。 5.13 RNA酶抑制剂。 5.14 TaqMan实时荧光PCR预混液:Taq DNA 聚合酶、PCR反应缓冲液、氯化镁、dNTPs(含dATP、 dUTP、dCTP、dGTP))和UNG酶按比例配制的溶液。 5.15 检测用引物和探针 PCR扩增及CRISPR反应所用引物、crRNA和探针序列详见表1。 表1 克罗诺杆菌属引物、crRNA与探针 引物/探针序列(5’→3’) 靶基因碱基数(bp) 引物F5’AACACGCTTTCTAACGTTGATAAGG3’ 引物R5’CTTTTGTCGTAAGAGCAGAGGTGAG 3’ crRNA5’CGAGCGAUCUGAGAAGUGGCACAUAAGGCCAAUAAUAAUG 3’fusAa25 25 40 Cas12b- tracrRNA5’GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCAC UUUCCAGGUGGCAAAGCCCGUUGAGCUUCUCAAAAA 3’— 48 探针 5’FAM-nnnnnnnnnnnn-Eclipse 3’ — 12PCR 扩增 产物 长度 65 bp a靶序列参见附录B。 2SN/T1632.4—2022 以正式出版文本为准6 仪器和耗材 6.1 PCR仪。 6.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.3 恒温水浴锅。 6.4 离心机:离心力≥13 000 g。 6.5 微量移液器:0.5 μL~10 μL,10 μL~100 μL,20 μL~200 μL,200 μL~1 000 μL。 6.6 涡旋震荡器。 6.7 荧光定量PCR仪或其他可检测荧光的设备。 6.8 恒温培养箱。 7 试样制备 7.1 增菌培养 按照GB 4789.40的方法进行样品制备和一次增菌,样品污染浓度较低时可进行二次增菌。取检 样100 g置灭菌锥形瓶中,加入900 mL已预热至44 ℃的缓冲蛋白胨水(参见附录A),用手缓缓地摇动 至充分溶解,36 ℃±1 ℃培养18 h±2 h。 7.2 DNA提取 采用下述方法提取DNA,也可使用等效的商品化DNA提取试剂盒提取制备模板DNA。 对于7.1获得的增菌液,采用如下方法制备模板DNA:吸取1 mL增菌液加入1.5 mL离心管中, 12 000 g离心3 min,弃上清;加入1 mL 0.85%无菌生理盐水,完全溶解沉淀,12 000 g离心3 min,弃 上清;加入100 μL无菌水混匀后沸水浴10 min,置冰上冷却;12 000 g离心12 min,上清液即为模 板DNA。 8 细菌基因组DNA的提取纯化 8.1 增菌液4 ℃留存。 8.2 取2 mL增菌液,置于5 mL离心管中,13 400 g离心2 min,弃上清,向沉淀中加入400 μL裂解 液,20 μL蛋白酶K,56 ℃振荡2 h,13 400 g离心5 min。 8.3 转移上清液到新的离心管中,加入与上清液等体积的酚/三氯甲烷/异戊醇(25∶24∶1,体积比)混 合液振荡混匀,13 400 g离心10 min,将上清液转移到新的离心管中,再次加入与上清液等体积的三氯 甲烷/异戊醇(24∶1,体积比)溶液,振荡混匀,13 400 g离心10 min,将上清液转移到新的离心管中。 8.4 加入2倍体积的预冷的无水乙醇溶液,混合均匀后室温放置20 min,13 400 g离心2 min,弃去上 清液,加入1 mL 70%乙醇溶液洗涤沉淀2次,弃去乙醇溶液,将DNA晾干后,加入50 μL TE溶液充分 溶解,置于4 ℃条件下备用。 8.5 也可用等效试剂盒提取模板DNA。 9 PCR扩增 9.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置 9.1.1 检测过程中分别设阴性对照、空白对照和阳性对照。 3SN/T1632.4—2022 以正式出版文本为准9.1.2