̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ICS 65.020.30 CCS B 41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1247—2022 代替SN/T 1247—2007 猪繁殖与呼吸综合征检疫技术规范 Quarantine protocol for porcine reproductive and respiratory syndrome 2022-07-07发布 2023-02-01实施 中华人民共和国海关总署发布̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件参考世界动物卫生组织(OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗手册》(2021版)3.9.6章起草,一 致性程度为非等效。 本文件代替SN/T 1247—2007《猪繁殖和呼吸综合征检疫规范》,与SN/T 1247—2007相比主要技 术变化如下: ———文件名称修改为《猪繁殖与呼吸综合征检疫技术规范》; ———增加了实时荧光反转录聚合酶链式反应试验方法(检测PRRSV通用型、美洲株和欧洲株); ———增加了附录C。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国大连海关、中华人民共和国成都海关、大连工业大学、中华人民共 和国南京海关、中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国沈阳海关、中华人民共和国兰州海关、中华人 民共和国农业科学院特产研究所、上海大学。 本文件主要起草人:贾赟、孙颖杰、万超、胡传伟、姜焱、徐博文、张素芳、陈沁、耿庆华、刘钊、徐超、 孙晓飞、简中友、袁文泽等。 本文件的历次版本发布情况为: 本文件于2007年首次发布,本次为第一次修订。 ⅠSN/T1247—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э ̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 猪繁殖与呼吸综合征检疫技术规范 1 范围 本文件规定了猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的临床诊断、病毒分离鉴定、免疫过氧化物酶单层试验 (IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)、间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)、反转录-聚合酶链式反应试 验(RT-PCR)、实时荧光反转录-聚合酶链式反应试验(Real time RT-PCR)诊断方法。 本文件适用于猪繁殖与呼吸综合征的检疫、监测和诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文本中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,凡是注日期的 引用文件,仅该日期的版本适用于本文件;凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单) 适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PRRS 猪繁殖与呼吸综合征 PRRSV 猪繁殖与呼吸综合征病毒 CPE 致细胞病变效应 PBS 磷酸盐缓冲盐水 IPMA 免疫过氧化物酶单层试验 IFA 间接免疫荧光试验 HRP 辣根过氧化物酶 RT-PCR 反转录聚合酶链式反应 Real time RT-PCR实时反转录聚合酶链式反应 RNA 核糖核酸 DEPC 焦碳酸二乙酯 Taq酶 Taq DNA聚合酶 dNTP 脱氧核苷三磷酸 bp 碱基对 EB 溴化乙锭 1SN/T1247—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 5 临床诊断 急性感染初期,猪群表现为食欲低下、发热、昏睡和精神不振等症状,个别猪可出现双耳、外阴、腹 部、口部青紫发绀,一般持续1周~3周;发病高峰的主要特征是母猪早产、流产、胎儿自溶和木乃伊胎 及弱仔增多;仔猪断奶前死亡率增加,高峰期一般持续8周~12周;发病末期,母猪繁殖功能逐渐恢复, 达到或接近病前水平。育肥猪存在不同程度呼吸系统症状,痊愈猪一般生长缓慢,体重较轻。若没有继 发感染,出生前后感染的仔猪,呼吸困难、急促,同时出现眼周及眼睑水肿、结膜炎、蓝耳、食欲不振、发 热、皮肤红斑、腹泻、震颤、毛发粗乱、厌食和神经症状。断乳仔猪感染PRRSV的典型临床症状表现为 发热、肺炎、昏睡及精神萎靡,如果伴发细菌感染,则死亡率显著升高。剖检病死猪,可见间质性肺炎并 伴有卡他性肺炎和肺水肿等特征病变,其他脏器一般不表现肉眼可见病变。可引起所有年龄段猪的高 烧(40 ℃~42 ℃)。 有以上临床症状者,可以怀疑猪群有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染,确诊需要实验室 检验。 6 病毒分离鉴定 6.1 材料准备 6.1.1 器材 二氧化碳培养箱、普通冰箱及低温冰箱、倒置生物显微镜、恒温水浴箱、离心机及离心管、96孔细胞 培养板、 微量移液器、组织研磨器、孔径0.2 μm的微孔滤器及滤膜。 6.1.2 试剂 RPMI 1640细胞培养液、 MEM细胞培养液、 犊牛血清、 青霉素(104 IU/mL)与链霉素(104 μg/mL)溶液、 7.5%碳酸氢钠溶液等。试验用水应符合GB/T 6682要求。 6.1.3 细胞 猪原代肺泡巨噬细胞培养物(PAM)、MARC-145。PAM由未感染过PRRS猪群中6周龄~8周龄 的猪获取,并经批次检验合格,制备和检验方法按照附录A执行。 6.1.4 样品 6.1.4.1 采样 无菌采取扁桃体、肺、淋巴结和脾等组织,血清或腹水置低温保存盒内立即送检。不能立即检测者, 应放-20 ℃冰箱中,长期保存应置于-70 ℃冰箱中。 6.1.4.2 制备 血清和腹水可直接检测。肺、脾和扁桃体等组织可单独检测,也可混合后检测。各组织剪碎后研磨 成糊状,加入RPMI 1640,制成10%的组织悬液,3 000 r/min离心15 min,吸取上清液,加入青霉素 500 IU/mL、链霉素500 μg/mL、庆大霉素500 μg/mL和两性霉素B 200 μg/mL。怀疑有细菌污染的 样品,也可用0.2 μm微孔滤膜过滤处理。 2SN/T1247—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 6.2 操作方法 6.2.1 制备细胞板 病毒分离首选PAM细胞,先将PAM细胞用RPMI 1640稀释(含犊牛血清5%, 青霉素100 IU/mL、链霉 素100 μg/mL、庆大霉素50 μg/mL、两性霉素B 10 μg/mL, pH7.2),稀释细胞终浓度为每毫升1×106 个细胞。或将MARC-145用MEM稀释,使细胞终浓度为每毫升5×104个细胞。然后,每孔100 μL 加入96孔细胞培养板中。 6.2.2 稀释样品 在空白96孔细胞培养板中加入细胞培养液RPMI 1640,每孔90 μL,在A排和E排各孔内分别加 入样品,每孔10 μL(样品1∶10稀释),将板轻轻摇动后,从A和E排孔各取10 μL分别移入B和F排 孔内(样品1∶100稀释)。将板轻轻摇动后,从B和F排孔各取10 μL分别移入C排和G排孔内(样品 1∶1 000稀释),将板轻轻摇动后,从C排和G排孔各取10 μL分别移入D排和H排孔内(样品 1∶10 000稀释)。每个培养板应设置空白对照。振动稀释板后加盖,置4 ℃冰箱内保存备用。 6.2.3 接种样品 分别吸取上述稀释样品50 μL接种于6.2.1中对应的细胞孔(第一代)中,放入37 ℃、 5%二氧化 碳培养箱中培养,每天观察CPE,连续观察2 d。 6.2.4 培养物盲传 一般在第一代培养2 d后,不论有无细胞病变,一律将每孔内细胞液取25 μL,整板移入按照6.2.1 方法制备的新细胞板对应的孔内。37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养2 d~5 d,每天观察CPE。 6.3 结果判定 通常在接种1 d~2 d后可出现CPE,主要呈现细胞圆缩、聚集、固缩,最后溶解脱落。初次接种样 品和盲传后都出现CPE,或盲传后出现CPE,经PCR或荧光PCR检测呈阳性结果的认定为阳性。仅 初次接种样品出现CPE,PCR呈阴性结果的认定为是由于病料毒性引起的假阳性。 在细胞培养物盲传结束后,不论是否出现CPE,对所有的孔必须采用免疫过氧化物酶单层试验(IP- MA)或间接免疫荧光试验(IFA)进行终判;只要对PRRSV标准阳性血清呈现阳性反应,则被认定为 PRRSV分离阳性。 7 免疫过氧化物酶单层试验(IPMA) 7.1 材料准备 7.1.1 器材 微量移液器、倒置显微镜等。 7.1.2 试剂 7.1.2.1 IPMA诊断板的制备:按照A.6执行。 7.1.2.2 标准阳性血清、标准阴性血清和兔抗猪IgG HRP结合物均由国家指定单位提供。使用前按 说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。 7.1.2.3 洗涤液、血清稀释液和显色/底物溶液按照附录B配制。试验用水应符合GB/T 6682要求。 3SN/T1247—2022̾ൣयѢྟ஠ఴ˝э 7.1.3 样品 采集被检猪血液,分离血清,血清应新鲜、透明、不溶血、无污染,密装于灭菌小瓶内,被检血清统一 编号,立即送检,当天送检于4 ℃保存,24 h以后送检的于-20 ℃冰箱保存。 7.2 操作方法 7.2.1 稀释血清样品:在空板的A排和E排各孔分别加入180 μL的血清稀释液,其余各孔加120 μL。 将20 μL被检血清和对照血清分别加入A排和E排各孔,缓慢摇动,从A排和E排各孔内取40 μL