ICS11.220 CCSB41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1088—2024 代替SN/T1088—2010,SN/T2436—2010,SN/T3506—2013 布鲁氏菌病检疫技术规范 Quarantineprotocolforbrucellosis 2024-12-31发布 2025-07-01实施 中华人民共和国海关总署发布目 次 前言 Ⅲ ………………………………………………………………………………………………………… 1 范围 1 ……………………………………………………………………………………………………… 2 规范性引用文件 1 ………………………………………………………………………………………… 3 术语与定义 1 ……………………………………………………………………………………………… 4 疾病概述 1 ………………………………………………………………………………………………… 5 临床症状与病理变化 1 …………………………………………………………………………………… 6 生物安全措施 1 …………………………………………………………………………………………… 7 病原鉴定 1 ………………………………………………………………………………………………… 7.1 显微镜检查 1 ………………………………………………………………………………………… 7.2 细菌培养 2 …………………………………………………………………………………………… 7.3 多重聚合酶链式反应(多重PCR) 2 ………………………………………………………………… 7.4 实时荧光聚合酶链式反应(实时荧光PCR) 5 ……………………………………………………… 8 血清学试验 8 ……………………………………………………………………………………………… 8.1 虎红平板凝集试验(RBT) 8 ………………………………………………………………………… 8.2 缓冲平板凝集试验(BPAT) 9 ……………………………………………………………………… 8.3 试管凝集试验(SAT) 9 ……………………………………………………………………………… 8.4 补体结合试验(CFT) 9 ……………………………………………………………………………… 8.5 酶联免疫吸附试验(ELISA) 10 ……………………………………………………………………… 8.6 荧光偏振试验(FPA) 10 ……………………………………………………………………………… 8.7 琼脂扩散试验(AGID) 11 …………………………………………………………………………… 8.8 全乳环状试验(MPT) 13 …………………………………………………………………………… 附录A(资料性) 疾病概述 14 ……………………………………………………………………………… 附录B(资料性) 临床症状与病理变化 15 ………………………………………………………………… 附录C(规范性) 试剂的配制 17 …………………………………………………………………………… ⅠSN/T1088—2024前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替SN/T1088—2010《布氏杆菌检疫技术规范》、SN/T2436—2010《山羊和绵羊布鲁氏菌病 检疫规程》、SN/T3506—2013《布氏杆菌病荧光偏振试验操作规程》,与SN/T1088—2010、SN/T2436— 2010、SN/T3506—2013相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: ———删除了聚合酶链反应(见SN/T1088—2010的5.3); ———增加了多重聚合酶链式反应(见7.3); ———增加了实时荧光聚合酶链式反应(见7.4); ———增加了试管凝集试验微量法(见8.3.2)。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国天津海关。 本文件主要起草人:王玉玲、王建华、张俊哲、刘誉、马鑫淼、赵丹、陈本龙、柴铭骏、王乃福、陈小金、 刘培、刘洋。 本文件所代替文件的历次版本发布情况为: ———SN/T1088,2002年首次发布,2010年第一次修订,修订时并入了SN/T1089—2002《布氏杆 菌病补体结合试验操作规程》、SN/T1090—2002《布氏杆菌病试管凝集试验操作规程》、 SN/T1394—2004《布氏杆菌病全乳环状试验方法》、SN/T1525—2005《布氏杆菌病微量补体 结合试验方法》; ———SN/T2436,2010年首次发布; ———SN/T3506,2013年首次发布。 ⅢSN/T1088—2024布鲁氏菌病检疫技术规范 1 范围 本文件规定了布鲁氏菌病的显微镜检查、细菌培养、多重聚合酶链式反应(多重PCR)、实时荧光聚 合酶链式反应(实时荧光PCR)、虎红平板凝集试验、缓冲平板凝集试验、试管凝集试验、补体结合试验、 酶联免疫吸附试验、荧光偏振试验、琼脂扩散试验、全乳环状试验等诊断技术。 本文件适用于布鲁氏菌病的临床诊断和实验室检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18646 动物布鲁氏菌病诊断技术 GB19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 疾病概述 见附录A。 5 临床症状与病理变化 见附录B。 6 生物安全措施 为了保护实验室人员和环境的安全,应由具备资格的工作人员进行布鲁氏菌病原鉴定和血清学检 验,应采取预防气溶胶感染的安全防护措施。所有培养物和废弃物应经高压灭菌后处置。病原分离培 养工作应在生物安全三级实验室中进行。生物安全措施应按照GB19489中的有关规定执行。 7 病原鉴定 7.1 显微镜检查 显微镜检查方法按GB/T18646执行。 1SN/T1088—20247.2 细菌培养 细菌培养方法按GB/T18646执行。 7.3 多重聚合酶链式反应(多重PCR) 7.3.1 仪器和设备 高速低温离心机、手掌式台式离心机、PCR扩增仪、水平电泳仪、凝胶成像分析仪、水浴锅、漩涡振 荡器、可调移液器。 7.3.2 试剂和材料 7.3.2.1 细菌基因组DNA提取试剂盒。 7.3.2.2 布鲁氏菌质控菌株:猪种布鲁氏菌标准菌株或其模板DNA。 7.3.2.3 10×Taqbuffer、dNTP混合液(2.5mmol/L,含镁离子)、TaqHS聚合酶(250U,5U/μL)或 其他适合的商品化的PCR试剂,5kbDNA分子质量标准(5kbDNAmarker)。 7.3.2.4 TE缓冲液、1×电泳缓冲液(1×TBE)、GelRed或其他适合的商品化的安全无毒核酸凝胶染色 试剂、10×加样缓冲液或其他适合的商品化加样缓冲液,按附录C配制。 7.3.2.5 琼脂糖。 7.3.2.6 试验用双蒸水(ddH2O):符合GB/T6682中的二级水。 7.3.2.7 移液器滴头:10μL、200μL、1000μL。 7.3.2.8 PCR反应管。 7.3.3 操作步骤 7.3.3.1 样品制备 7.3.3.1.1 标准菌株:用无菌接种环挑取单个布鲁氏菌质控菌株菌落,放入200μL无菌双蒸水。 7.3.3.1.2 样品:可疑布鲁氏菌培养物,用接种环挑取单个可疑菌落于200μL无菌双蒸水。 7.3.3.2 DNA模板的提取 将7.3.3.1制备的菌悬液80℃灭活2h,按适合的基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取模板 DNA,然后12000r/min离心20s,取上清液作为PCR扩增时模板DNA(DNA浓度为0.1μg/μL~ 0.05μg/μL)。 7.3.3.3 引物 PCR引物序列见表1。 表1 PCR引物序列 序号 引物 序列5'→3' 扩增片段大小/bp 1 BMEI0998—F ATC-CTA-TTG-CCC-CGA-TAA-GG 1682(2524a) BMEI0997—R GCT-TCG-CAT-TTT-CAC-TGT-AGC 2 BMEI0535—F GCG-CAT-TCT-TCG-GTT-ATG-AA 450(1320b) BMEI0536—R CGC-AGG-CGA-AAA-CAG-CTA-TAA 2SN/T1088—2024表1 PCR引物序列(续) 序号 引物 序列5'→3' 扩增片段大小/bp 3 BMEII0843—F TTT-ACA-CAG-GCA-ATC-CAG-CA 1071 BMEII0844—R GCG-TCC-AGT-TGT-TGT-TGA-TG 4 BMEI1426—F TCG-TCG-GTG-GAC-TGG-ATG-AC 774 BMEI1427—R ATG-GTC-CGC-AAG-GTG-CTT-TT 5 BMEII0428—F GCC-GCT-ATT-ATG-TGG-ACT-GG 587 BMEII0428—R AAT-GAC-TTC-ACG-GTC-GTT-CG 6 BR0953—F GGA-ACA-CTA-CGC-CAC-CTT-GT 272 BR0953