ICS11.220 CCSB41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1087—2024 代替SN/T1087—2011 Q热检疫技术规范 QuarantineprotocolforQfever 2024-12-31发布 2025-07-01实施 中华人民共和国海关总署发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替SN/T1087—2011《Q热检疫技术规范》,与SN/T1087—2011相比,除结构调整和编 辑性改动外,主要技术变化如下: ———增加了聚合酶链式反应(PCR)(见第9章); ———增加了实时荧光聚合酶链式反应(实时荧光PCR)(见第10章)。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国石家庄海关、中华人民共和国广州海关、中华人民共和国温州 海关。 本文件主要起草人:王建昌、王素华、佟铁铸、王金凤、鱼海琼、鄢志强、柯忠哲、马保华、刘立兵、 孙晓霞。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———2002年首次发布为SN/T1087—2002,2011年第一次修订; ———本次为第二次修订。 ⅠSN/T1087—2024Q热检疫技术规范 1 范围 本文件描述了Q热的病原分离鉴定、聚合酶链式反应、实时荧光聚合酶链式反应和血清学试验检 测方法,其中血清学试验包括间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验和补体结合试验。 本文件适用于进出境牛、羊等易感动物Q热的检疫和诊断,也适用于动物组织、血液、奶液、毛和皮 等动物产品和蜱中Q热病原的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB19489 实验室 生物安全通用要求 SN/T2123 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 SN/T2984—2011 检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件: C.Burnetii:贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetii); CPE:致细胞病变效应(Cytopathiceffect); DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid); ELISA:酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbentassay); FAM:6-羧基荧光素(6-Carboxyfluorescein); FITC:异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate); HEL:人胚肺成纤维细胞(Humanembryoniclungfibroblasts); IFA:间接免疫荧光试验(Indirectimmunofluorescenceassay); OD值:光密度值(Optimaldensity); PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphatebufferedsolution); PCR:聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction); QFever:Q热(Queryfever); VBD:巴比妥缓冲液(Barbituratebuffer)。 1SN/T1087—20245 试验操作生物安全要求 本文件所列各项试验操作应按照SN/T2984—2011中3.1的规定执行,具体防护措施及要求应按 照GB19489的规定执行。 6 临床诊断 6.1 疫病概述 Q热概述见附录A。 6.2 临床症状 家畜患Q热的症状主要有怀孕后期的流产、早产、死产、弱仔、胎衣不下、子宫内膜炎和不育。小反 刍兽患Q热常伴发畜群突然流产,康复后感染可持续多年或终生。 6.3 剖检变化 流产胎儿的脾脏、肝脏、肾脏和生殖器官有大小不一的坏死灶和增生组织或肉芽肿。 6.4 结果判定 易感动物出现上述临床症状和剖检变化,可初步判定为疑似Q热,确诊需要进行实验室诊断。 7 样品采集、保存、运送与处理 7.1 采样技术要求 样品采集、运输和保存应按照SN/T2123的规定执行。 7.2 样品采集 7.2.1 组织样品 采集出现流产、死胎或弱犊、胎衣不下、子宫内膜炎的病畜胎盘子叶、肝、肺、流产胎儿皱胃内容物等 组织样品,用灭菌剪刀剪取所需器官的组织块,每个组织块应单独放在已消毒的容器内,每份质量为 10g~50g,注明采样日期、组织和动物名称等。 7.2.2 全血样品 用一次性含有非肝素(EDTA等)抗凝剂的真空采血管,由动物静脉无菌采血,充分混匀后静置。 7.2.3 血清样品 用一次性真空血清采血管,由动物静脉无菌采血,连续摇匀,待血清凝集后,分离血清。 7.2.4 分泌物和粪便拭子 用医用棉签在分娩或流产动物以及病死、发病动物的肛门或阴道内旋转数圈并蘸取少量粪便或分 泌物,将采集后的棉拭子立即放入盛有2mLPBS的采样管中。 2SN/T1087—20247.2.5 生毛皮、毛、绒和鬃样品 从同批样品的不同部位共抽样5g~10g,装入无菌采样袋,密封。 7.2.6 蜱样品 牛、羊等动物身下铺放白布,使用乙醚(或松节油、煤油、三氯甲烷)涂抹蜱头部,待蜱自行从动物身 体脱落。用镊子摘取脱落蜱,放置在1.5mL灭菌离心管中。对于动物皮毛携带的蜱,可直接用镊子摘 取,放置在1.5mL灭菌离心管中。 7.2.7 奶液样品 采集奶液于灭菌50mL离心管中,尽量于清晨采取,采前用温热毛巾将乳房擦拭干净,用2%碘伏 将乳头消毒,将头3把~4把乳汁弃去,采集后续奶液。 7.3 样品保存及运送 采集的样品应在取样后4℃冷藏24h内送至实验室,应附有标签或采样单,表明采样地点、动物来 源、采样数目、临床症状和采样时间、采样人等信息。 7.4 样品处理 7.4.1 组织样品 取适量组织样品,剪碎,按1∶5的比例加入灭菌的含抗生素(链霉素100μg/mL~200μg/mL和 庆大霉素50μg/mL~100μg/mL)的0.1mol/LPBS(pH7.4),用组织研磨仪充分研磨5min~ 10min,制备成组织匀浆液;移入离心管,充分振荡,75℃温浴0.5h~1h;15000g离心10min,弃上 清,加1mLPBS,振荡混匀,使沉淀充分悬浮,15000g离心10min,弃上清,收集沉淀物,置于-20℃ 贮存备用。 7.4.2 全血样品 取1mL~2mL全血样品,编号,15000g离心10min,弃上清。加等体积灭菌双蒸水充分振 荡,15000g离心10min,弃上清。若红细胞裂解不完全,需采用灭菌双蒸水重复洗涤。收集沉淀物,置 于-20℃贮存备用。 7.4.3 血清样品 无菌分离血清,装入2.0mL离心管中,编号,用于抗体检测。 7.4.4 棉拭子样品 将采集的分泌物拭子和粪便拭子加入1mL灭菌的0.1mol/LPBS(pH7.4),于振荡器上充分振荡 混匀,将拭子中的液体充分挤压后弃去拭子,编号,置于-20℃贮存备用。 7.4.5 生毛皮、毛、绒和鬃样品 取1g样品放入灭菌三角瓶中,加入30mL4℃预冷的0.5%TritonX-100PBS溶液,将瓶口塞 严,冰浴或置于4℃冰箱内,间或摇动1h。将瓶中液体倒入50mL灭菌离心管中,盖住管口,3000g离 心10min去除样品中大的颗粒。取上层悬液15000g离心10min,弃上清,加1mLPBS充分振荡混 匀;将沉淀悬浮液移入1.5mL离心管,15000g离心10min,弃上清,收集沉淀物,置于-20℃贮存 3SN/T1087—2024备用。 7.4.6 蜱样品 将采集的蜱使用75%乙醇清洗后,研磨,置于-20℃贮存备用。 7.4.7 奶液样品 采集10mL新鲜奶液,加100μLTritonX-100,振荡混匀,2500g离心20min,弃上清,加1mL PBS,充分振荡混匀;将沉淀悬浮液移入1.5mL离心管,15000g离心10min,弃上清,收集沉淀物,置 于-20℃贮存备用。 8 病原分离和鉴定 8.1 材料准备 8.1.1 器材 8.1.1.1 荧光显微镜。 8.1.1.2 倒置显微镜。 8.1.1.3 二氧化碳培养箱。 8.1.1.4 5cm2细胞培养瓶。 8.1.1.5 24孔平底细胞培养板。 8.1.1.6 带盖湿盒。 8.1.1.7 组织研磨仪。 8.1.1.8 冷冻离心机(-10℃~+40℃)。 8.1.2 试剂 8.1.2.1 无C.Burnetii抗体犊牛血清。 8.1.2.2 人胚肺成纤维细胞(HEL)。 8.1.2.3 C.Burnetii标准菌株和标准阳性、阴性血清、C.Burnetii荧光抗体。 8.1.2.4 溶液及细胞培养液:见附录B。 8.1.2.5 链霉素、庆大霉素。 8.2 病原分离 按常规方法培养HEL单层细胞,倒去培养液,接种处理过的样品,每样接种3瓶,每瓶接种1mL。 于37℃吸附2h后加细胞维持液,封闭、置37℃含5%二氧化碳箱培养,24h后逐日在倒置显微镜下观 察细胞病变,连续观察21d。C.Burnetii特征性细胞致病效应为HEL细胞空泡化。无CPE的盲传 2代。如有CPE,则待70%细胞出现CPE时收毒,将细胞反复冻融2次,3000r/min离心20min,取上 清液4℃保存待鉴定。 8.3 培养物的鉴定 8.3.1 将生长良好的细胞用细胞分散液处理后